Окрашивание с помощью проточной цитометрии субпопуляций макрофагов, инфицированных Mycobacterium tuberculosis

Начнем с адгезивных субпопуляций макрофагов М1 и М2, отличающихся специфическими поверхностными маркерами. Эти клетки инфицированы мечеными флуоресцентными микобактериями туберкулеза.

Добавьте буфер FACS в лунки для культуры.

ЭДТА в буфере обеспечивает отделение клеток от культуральных лунок.

Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки.

Центрифугируйте пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в коктейле антимакрофагальных антител с флюорохромом и красителе для жизнеспособности Zombie-UV.

Флуоресцентный краситель Zombie-UV проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны и связывается с цитоплазматическими белками, обеспечивая четкую дифференцировку от жизнеспособных неокрашенных клеток.

Кроме того, флуоресцентно-конъюгированные антимакрофагальные антитела связываются с антигенами-мишенями на макрофагах, что позволяет дифференцировать субпопуляции.

Промойте клетки, чтобы удалить несвязанные антитела. Центрифуга. Удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в фиксирующем буфере для сшивания белков, сохраняя морфологию клеток и инактивируя микобактерии для безопасного использования во время анализа.

Наконец, центрифугируйте и обработайте образцы для проточной цитометрии.

Используйте соответствующую стратегию гейтирования для определения процента субпопуляций, инфицированных микобактериями.

Чтобы окрашивать клетки для проточной цитометрии, инкубируйте инфицированные клетки с 1 миллилитром буфера FACS с добавлением 0,5 миллимоляра ЭДТА на лунку в течение не менее 30 минут. В конце инкубации соберите отделенные клетки с помощью щадящего пипетирования и переложите клетки в отдельные микроцентрифужные пробирки с винтовыми крышками для центрифугирования.

Ресуспендируйте клетки примерно в 50 микролитрах коктейля из конъюгированных с флуорохромом античеловеческих антител и представляющего интерес красителя для жизнеспособности и инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, защищенной от света.

После промывания зафиксируйте ячейки 200 микролитрами свежеприготовленного фиксирующего буфера на 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. После фиксации и промывки суспендируйте клетки в 400 микролитрах буфера FACS, а также переложите клетки в микроцентрифужные пробирки объемом 1 миллилитров

.

Чтобы проанализировать клетки, используйте компенсационные шарики для компенсации флуоресцентного сигнала для каждого флюорохром-конъюгированного антитела в коктейле, и используйте неокрашенные клетки для установки ворот для популяции отрицательных клеток. Затем приобретите минимум 50 000 клеток на образец.