Анализ in vitro для изучения цитотоксической способности цитокин-индуцированных клеток-киллеров

Возьмите культуру раковых клеток с флуоресцентно мечеными цитоплазматическими белками.

Добавьте цитокин-индуцированные киллеры или CIK — эффекторные Т-клетки с естественными характеристиками киллеров, обладающие противоопухолевой активностью.

Рецепторы D или NKG2D группы естественных киллеров группы 2 на клетках CIK связываются со стресс-индуцируемыми белками на раковых клетках.

Связывание индуцирует клетки CIK высвобождать токсины цитоплазматических гранул — перфорины и гранзимы.

Перфорины образуют поры в мембране раковых клеток, обеспечивая проникновение гранзимов, которые активируют каспазы, вызывая апоптоз.

После инкубации соберите клетки. Добавьте флуоресцентный краситель для обеспечения жизнеспособности клеток, связывающий нуклеиновые кислоты.

Краситель проникает через поврежденную клеточную мембрану и связывается с ДНК, в результате чего образуются мертвые клетки с двойным окрашиванием.

Благодаря интактной клеточной мембране живые клетки непроницаемы для красителя.

Пропустите клетки через проточный цитометр, чтобы обнаружить живые клетки с одиночной флуоресценцией и мертвые клетки с двойной флуоресценцией.

Создайте точечную диаграмму для измерения процента мертвых раковых клеток, количественно оценив цитотоксический эффект клеток CIK.

Для проведения цитотоксического анализа совместно культивируют CIK и клетки хронического миелоидного лейкоза человека K562, добавляя по 1 миллилитру клеток K562 в каждую лунку в 6-луночном планшете с плотностью 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Затем добавьте 1 миллилитр базальной среды с клетками CIK или без них в 6-луночный планшет, как указано в текстовом протоколе. Смешайте клеточные суспензии, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее трех раз.

Поместите тарелку в инкубатор на 24 часа. Теперь совместно культивируйте CIK и клетки яичников OC-3, добавив 1 миллилитр базальной среды с клетками CIK или без них в 6-луночный планшет, как указано в текстовом протоколе. Перемешайте клеточные суспензии, аккуратно пипетируя лезвием вверх и вниз не менее трех раз в инкубаторе в течение 24 часов. После инкубации соберите клеточную суспензию CIK-K562 непосредственно в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров.

Чтобы собрать как суспензию, так и адгезивные клетки из групп CIK-OC-3, сначала перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую стерильную пробирку. Промойте лунку 1 миллилитром стерильного PBS. Соберите PBS, и добавьте его в трубку. Затем добавьте 0,5 миллилитра раствора фермента диссоциации клеток и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Добавьте 1 миллилитр раствора из той же пробирки в соответствующую лунку, и аккуратно перемешайте клетки путем пипетирования вверх и вниз не менее трех раз стерильной пипеткой объемом 1 миллитр. Соберите все клетки в одну пробирку. Центрифугируйте при 300 х г в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 миллилитре стерильного PBS. Гранулируйте ячейки при 300 х г в течение 10 минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах стерильного PBS.

Добавьте в клеточную суспензию 5 микролитров красителя 7-AAD. Аккуратно перемешайте клетки, пипетируя вверх и вниз не менее трех раз стерильной пипеткой объемом 1 миллилитров. Выдержите 10 минут, а перед анализом оставьте в темноте.

Для проведения анализа цитолитической способности смешать клеточную суспензию и повторить приготовление для проточной цитометрии. Нажмите кнопку Новый образец, чтобы добавить образец и пробирку в эксперимент. Назовите трубки так, как указано в текстовом протоколе.

Чтобы создать систему точечного затвора для цитолитического анализа, сначала выберите пробирку 1 и нажмите кнопку «Точечная диаграмма». Чтобы создать график FSC-A/SSC-A, нарисуйте прямоугольный вентиль над всеми событиями с пороговым значением FSC-A больше 50 000, чтобы исключить мусор клетки. Выберите параметр SSC-A/CFSE для новой точечной диаграммы. Затем выберите параметр 7-AAD/CFSE для новой точечной диаграммы и нарисуйте четырехквадрантный вентиль для определения четырех субпопуляций.

Нажмите кнопку Загрузить образец, чтобы сначала проанализировать пустой контрольный образец. Отрегулируйте напряжение SSC-A и FSC-A. Идентификация популяции мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7-AAD. Запишите данные из более чем 20 000 CFSE-положительных клеток в каждом образце. Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, чтобы проанализировать популяции нежизнеспособных клеток, и экспортируйте данные в файлы анализа.