Окрашивание бактериальных клеток и подготовка к иммунологическим исследованиям

Начните с пробирки, содержащей бактериальную культуру в экспоненциальной фазе, обеспечивая однородность и активное выращивание бактерий для стабильных результатов.

Центрифуга для сбора клеток; аспирация содержащего мусор надосадочной жидкости и ресуспендирование клеток.

Введите проницаемый для клеток красный флуоресцентный краситель. Молекулы красителя проникают через клеточную мембрану бактерии и достигают нуклеоида, связываясь с ДНК и придавая бактериям красную флуоресценцию.

Центрифуга для гранулирования окрашенных бактерий и аспирации несвязанного надосадочного вещества, содержащего краситель.

Ресуспендируйте бактерии в питательную среду для поддержания жизнеспособности клеток.

С помощью фотометра измерьте абсорбцию разбавленной бактериальной суспензии на 600 нанометрах.

Сравните значение поглощения со стандартной кривой, чтобы определить концентрацию бактерий.

Перелейте нужный объем окрашенной бактериальной суспензии в свежую пробирку, содержащую питательную среду. Это необходимо для достижения желаемой бактериальной концентрации инфекции в клетке-хозяине, представляющей множественность инфекции, или MOI.

Окрашенные бактерии с нужным MOI готовы к иммунологическим исследованиям.

Во-первых, соберите бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования при 13 000 g в течение двух минут при комнатной температуре. После промывки клеточной гранулы одним миллилитром PBS ресуспендируйте бактериальную гранулу в одном миллилитре PBS.

Определение концентраций бактериальной суспензии путем измерения оптической плотности на 600 нанометрах. Затем для окрашивания бактериальной суспензии добавьте два микролитра 500-кратного концентрированного стокового зеленого или красного красителя в один миллилитр бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в один раз. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 30 минут с аккуратным вращением в темноте.

Через 30 минут центрифугируйте окрашенные бактерии в 13 000 раз g в течение двух минут и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS. Соберите окрашенные бактериальные клетки центрифугированием при 13 000 раз g в течение двух минут. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре свежей среды F-12K и измерьте оптическую плотность каждой культуры на 600 нанометрах. Последовательно разбавляйте культуры до желаемых концентраций, исходя из кратности инфекции и концентрации клеток хозяина.