Оценка внутриклеточного фосфорилирования стромальных цитокинов с помощью фосфопроточной цитометрии

Принимайте клетки лейкемии в питательных средах без стимулирующих факторов, таких как цитокины, и инкубируйте их.

Отсутствие стимулирующих факторов позволяет внутриклеточным фосфорилированным белкам подвергаться дефосфорилированию и возвращаться в исходные состояния.

Центрифугируйте и удалите среду. Ресуспензирует клетки в строме-надосадочную жидкость, содержащую цитокин, стромальный лимфопоэтин тимуса или TSLP.

TSLP связывается со своим рецептором на лейкозной клетке, запуская димеризацию рецептора.

Это сближает две янус-ассоциированные киназы, или JAK, способствуя взаимному трансфосфорилированию.

Активированные JAKs фосфорилируют цитоплазматические хвосты рецептора, создавая стыковочные сайты для преобразователя сигнала и активатора транскрипции, мономеров STAT.

После фосфорилирования STATs димеризуются и отделяются от рецептора, чтобы регулировать последующие клеточные процессы.

Фиксируют клетки для поддержания состояний фосфорилирования внутриклеточных белков.

Обработайте клетки раствором для пермеабилизации, чтобы увеличить проницаемость клеточной мембраны.

Добавьте флуоресцентно меченые антитела для мечения фосфорилированных белков.

Проточно-цитометрическое измерение сигнала флуоресценции коррелирует с TSLP-индуцированным фосфорилированием STAT.

Для валидации надосадочной жидкости, полученной из сконструированной стромы, разморозьте образцы надосадочной жидкости, собранные в контрольной части в строме, экспрессирующей цитокины, и наберите 3 лунки клеточных линий лейкемии в каждой концентрации в среде R20 в соотношении от 2 до 10 до 5 клеток на лунку в 96-луночном тканевом планшете. Инкубируйте клетки в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы обеспечить потерю фосфорилирования из их предыдущей культуры.

Затем перенесите клетки из каждой лунки в отдельные 4-миллилитровые пробирки и соберите клетки с помощью центрифугирования. Ресуспендируйте гранулы в дозе 600 микролитров на каждое экспериментальное условие и нанесите 200 микролитров клеток на лунку для каждого условия в трех экземплярах. Инкубируйте клетки в течение соответствующего периода в соответствии со специфическим коммерческим фосфоанализом.

В конце инкубации гранулируйте клетки центрифугированием и пометьте клетки с помощью окрашивания фосфопроточной цитометрией в соответствии с протоколом производителя. Затем проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии с использованием стандартных протоколов проточного цитометрического анализа, чтобы убедиться, что цитокин в надосадочной жидкости стромы фосфорилирует клетки лейкемии.