Визуализация бактерий в срезах биопсии мочевого пузыря с помощью флуоресцентной гибридизации in situ

Начните со предметного стекла с депарафинизированным и регидратированным инфицированным срезом ткани биопсии мочевого пузыря, содержащим уропатогенные бактерии.

Введение флуоресцентно меченных универсальных зондов — комплементарного одноцепочечного олигонуклеотида, специфичного для консервативной области бактериальной 16s рибосомальной РНК, или 16s-рРНК.

Инкубируйте предметное стекло в темноте при повышенной температуре для оптимальной гибридизации.

Во время инкубации зонды гибридизуются исключительно с консервативной областью на бактериальной 16s-рРНК, придавая бактериям зеленую флуоресценцию.

После гибридизации промойте предварительно подогретым буфером, чтобы удалить несвязанные зонды.

Окрашивайте участок ткани красителем Хёхста и маркерами клеточных белков, меченных флуорофорами.

Молекулы Хёхста связываются с ДНК, окрашивая ядра в синий цвет, в то время как меченые флуорофорами маркеры взаимодействуют со специфическими компонентами клетки, такими как муцин и актиновые филаменты, придавая красную флуоресценцию в биопсийном срезе.

Промойте предметное стекло и добавьте монтажный материал в секцию салфетки.

Под конфокальным микроскопом зеленая флуоресценция в красном флуоресцентном срезе биопсии мочевого пузыря подтверждает наличие тканеассоциированных бактерий.

Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, добавив в резервуар коробки для наконечников P1000 смоченную, смятую, деликатную рабочую салфетку и стерильную воду. Поместите картридж держателя наконечника сверху, так как именно там будут располагаться салазки. Когда окончательная стирка будет завершена, снимите предметное стекло с решетки для слайдов и положите их на свежее бумажное полотенце салфеткой вверх. Используйте деликатную салфетку, чтобы высушить предметное стекло, осторожно промакивая только рядом с биопсийным участком, но не на него, чтобы отвести воду. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте границу вокруг биопсийного участка и поместите предметное стекло стороной вверх в увлажняющую камеру.

Далее поместите увлажняющую камеру в инкубатор, установленный на 50 градусов Цельсия. Нанесите пипеткой от 50 до 150 микролитров красящего раствора непосредственно на ткань так, чтобы прямоугольник, образованный гидрофобной границей вокруг ткани, заполнился, и аккуратно закройте коробку. Инкубируйте в течение ночи при температуре 50 градусов Цельсия в темноте. Если в инкубаторе есть окно, закройте его алюминиевой фольгой для создания темной среды.

На следующее утро снимите предметные стекла с увлажняющих камер и быстро удалите остатки гибридизационного раствора с помощью деликатной рабочей салфетки. Затем поместите предметные стекла в вертикальную решетку для окрашивания. Поместите решетку для окрашивания в банку из коплина, обернутую алюминиевой фольгой, содержащую 100 мл предварительно подогретого буфера для стирки, на 10 минут. Повторите этот шаг промывки еще два раза со свежим буфером для промывки в новых банках с коплином.

Во время этих этапов стирки приготовьте противопятнопятиное, разбавив стоковый раствор Hoechst 33342 в буфере для стирки в соотношении 1 к 1 000. В ту же пробирку добавьте агглютинин зародышей пшеницы Alexa-555 до конечной концентрации пять микрограммов на миллилитр и фаллоидин Alexa-555 до конечной концентрации 33 наномоляра. Хранить в темноте до использования.

Когда окончательная стирка будет завершена, снимите предметные стекла с банки с коплином и аккуратно удалите излишки буфера для стирки с помощью деликатной рабочей салфетки. Положите предметные стекла салфеткой вверх на бумажное полотенце и добавьте от 50 до 150 микролитров противокрасителя прямо поверх ткани, чтобы гидрофобная граница была заполнена, но не переполнялась. Накройте крышкой криобокса до четырех предметных стекол, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут.

После этого поместите предметные стекла обратно в решетку для окрашивания и промойте их еще дважды в банках с коплином, содержащих свежий буфер для стирки, при этом каждая стирка длится 10 минут. Затем тщательно высушите предметные стекла и положите их салфеткой вверх на бумажное полотенце под крышкой криобокса. Выдавите одну каплю монтажного материала непосредственно на ткань и аккуратно положите сверху покровное стекло подходящего размера. Осторожно выдавите все пузырьки и дайте застывшим предметным стеклам застыть в течение ночи в темноте. На следующий день запечатайте края покровных стекол на предметном стекле легким слоем прозрачного лака для ногтей и дайте высохнуть в темноте в течение 10 минут, прежде чем хранить их в темноте при температуре 4 градуса Цельсия.

Когда вы будете готовы к изображению окрашенной биопсии, включите конфокальный микроскоп и программное обеспечение, связанное с микроскопом. Начните с FISH-положительного слайда и переключитесь в режим компьютерной визуализации. Выберите каналы для 405, 488 и 555. Установите отверстие, используя самый длинный канал длины волны, которым в данном случае является 555. Затем найдите текущую фокальную плоскость для визуализации меченых бактерий в канале 488. Не меняя фокальную плоскость, установите усиление, мощность лазера и смещение для каждого канала, чтобы сигнал не был насыщен, а фон не подвергался чрезмерной коррекции. Получите изображение по всем трем каналам.