Метод in vitro для генерации апоптотических Т-клеток с помощью ультрафиолетового облучения

Примите суспензию клеток Юрката — клеток лейкоза Т-лимфоцитов.

Смешайте аликвоту с красителем для повышения жизнеспособности клеток и обеспечьте достаточное количество живых клеток.

Поместите клетки в чашку для культивирования и облучите ультрафиолетом C или UVC в течение необходимого времени.

УФ-С проникает в клетки и поглощается ДНК, образуя пиримидиновые фотопродукты.

После облучения инкубируйте клетки. Обширное УФ-опосредованное повреждение ДНК инициирует внутренний путь апоптоза, активируя проапоптотические белки на внешней митохондриальной мембране.

Активированные белки олигомеризуются, образуя мембранные поры и высвобождая цитохром С из межмембранного пространства в цитоплазму.

Цитохром С образует комплексы с фактором активации апоптотической протеазы-1, образуя комплекс апоптосомы. Апоптосома активирует каспазы, вызывая апоптоз.

Введите меченный флуорофорами аннексин V для мечения фосфатидилсерина на мембране, маркера апоптотических клеток, и добавьте йодид пропидия, который проникает через поврежденную мембрану для мечения ДНК.

С помощью проточной цитометрии определить раннеапоптотические клетки, меченные аннексином V, и поздние апоптотические клетки с двойным окрашиванием.

Начните с культивирования Jurkat T клеток в базальной клеточной культуральной среде, дополненной в соответствии с указаниями в рукописи, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Т-клетки Jurkat представляют собой суспензию клеточной линии, которую можно поддерживать путем пропускания в предварительно подогретую питательную среду каждые три дня.

Подготовьте апоптотические клетки, вырастив их до 90% конфлюенции, что занимает три-четыре дня после пассирования. Выращивайте клетки в пяти колбах Т75, чтобы получить достаточное количество клеток для этого протокола. Как только клетки будут готовы, отсасывайте содержимое колбы около 24 миллилитров, и перекладывайте их в 50-миллилитровую коническую трубку. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипановым синим цветом и гемоцитометра.

Гранулируйте клетки центрифугированием в 271 раз g в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем ресуспендируйте клетки в среде, чтобы получить три миллиона клеток на миллилитр. Аликвотируйте клетки в чашки для культуры тканей размером 100 на 20 миллиметров, перенося пять миллилитров клеток в чашку.

Приготовьте примерно девять блюд культуры. Отложите одну посуду в сторону, чтобы она не подвергалась воздействию ультрафиолета, а остальные посуды подвергайте воздействию ультрафиолета. Установите УФ-сшиватель на правильный уровень энергии, нажав кнопку энергии и введя «600» с цифровой клавиатуры. Облучайте все сосуды с клетками, кроме контрольной, обязательно снимая верхнюю крышку чашки для тканевых культур во время воздействия ультрафиолета.

Затем инкубируйте все чашки в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение четырех часов. После инкубации объедините все облученные клетки в 50-миллилитровую коническую пробирку и гранулируйте их центрифугированием в 271 раз g в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 24 миллилитрах стерильного PBS. Снова центрифугируйте пробирку, и удалите надосадочную жидкость.