Анализ активации базофилов в присутствии исследуемого аллергена с помощью проточной цитометрии

Возьмем, к примеру, цитометрические трубки, содержащие окрашивающую смесь, содержащую флуоресцентно меченые моноклональные антитела, суспендированные в стимулирующем буфере.

Добавьте уменьшающиеся концентрации исследуемого аллергена в несколько пробирок. Добавьте антитела против IgE в одну пробирку, чтобы они служили IgE-опосредованным положительным контролем, и добавьте буфер в другую пробирку для отрицательного контроля.

Пипеткой подайте человеческую периферическую кровь в пробирки. Инкубировать.

Если человек сенсибилизирован к испытуемому аллергену, это воздействие приводит к тому, что аллерген связывается с аллерген-специфическими антителами IgE, связанными с Fc-рецепторами на поверхности базофилов.

Аллергены сшивают IgE-связанные Fc-рецепторы, вызывая активацию базофилов.

Базофилы подвергаются дегрануляции, высвобождая внутриклеточные гранулы, содержащие медиаторы воспаления, с активацией молекул CD63 и CD203c.

Флуоресцентно меченные моноклональные антитела связываются с CD63, CD203c и CCR3 на базофилах соответственно.

Понизьте температуру, чтобы остановить дегрануляцию базофилов.

Добавьте буфер к лизиру эритроцитов и закрепите клетки.

С помощью проточного цитометра определить базофилы из популяции лимфоцитов.

Используя CD63 в качестве маркера активации, проанализировать активацию базофилов при снижении концентраций аллергенов.

Начните со сбора периферической крови в 9-миллилитровые гепаринизированные пробирки и поместите образцы в ротор, чтобы поддерживать их при комнатной температуре до тех пор, пока они не потребуются для экспериментального протокола.

Пометьте две 5-миллилитровые цитометрические трубки для отрицательного и положительного контроля. Кроме того, пометьте по одной пробирке для различных концентраций испытуемых аллергенов или лекарств. Затем поместите трубки в решетку так, чтобы трубки идеально прилегали, не скользя.

Для первого положительного контроля готовят 4 микромолярный раствор N-формилметионил-лейцилфенилаланина, или fMLP, в 0,05% PBST для подтверждения качества базофилов. Для второго положительного контроля приготовьте 0,05 мг на миллилитр раствора анти-IgE с использованием PBST. Приготовьте красящую смесь, добавив по 1 микролитру антител CCR3-APC, CD203c-PE и CD63-FITC на 20 микролитров стимулирующего буфера. Затем добавьте по 23 микролитра этой красящей смеси в каждую тюбик.

Добавьте 100 микролитров PBST в отрицательные контрольные трубки, добавьте 100 микролитров fMLP в одну из положительных контрольных трубок и добавьте 100 микролитров анти-IgE в другую. К остальным пробиркам добавьте 100 микролитров различных концентраций аллергена или лекарства и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации аккуратно добавьте по 100 микролитров крови в каждую пробирку, чтобы избежать гемолиза. Затем аккуратно перебейте трубки и инкубируйте их в течение 25 минут при температуре 37 градусов Цельсия в термостатической ванне со средним перемешиванием.

Держите пробирки при температуре 4 градуса Цельсия не менее пяти минут, чтобы остановить дегрануляцию. В каждую пробирку добавьте 2 миллилитра лизирующего буфера для лизиса эритроцитов. Сделайте вихревую жидкость в каждой трубке, а затем инкубируйте трубки в течение 5 минут при комнатной температуре. Центрифугируйте пробирки при давлении 300 х г при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Затем переверните решетку в раковину, чтобы сцедить надосадочную жидкость, пока клетки остаются на дне пробирок. Добавьте 3 миллилитра PBST в каждую трубку, чтобы промыть клетки, и сделайте трубки вихревыми. Проведите второй раунд центрифугирования с использованием того же набора параметров и сцедите надосадочную жидкость, перевернув решетку в раковину. Затем держите образцы при температуре 4 градуса Цельсия, защищенные от света до проточной цитометрии.

Подключите проточный цитометр к компьютерному программному обеспечению и дождитесь готовности цитометра. Загрузите шаблон и настройки инструмента, как описано в текстовой рукописи. Начните процесс получения образца.

Чтобы выбрать активированные базофилы, сначала получите лимфоциты из графика Side Scatter - Forward Scatter. Затем получите базофилы из популяции лимфоцитов в виде CCR3-положительных CD203c-положительных клеток и приобретите не менее 500 базофилов в каждой пробирке. Установите CD63-отрицательный порог примерно на 2,5% с помощью пробирок с отрицательным контролем и проанализируйте образцы.