Методика экстракции нуклеиновых кислот из крови с помощью магнитных стеклянных частиц

Возьмите пробирку, содержащую свежевзятую кровь человека, и добавьте буфер для лизиса.

Детергент в буфере проникает через клеточную мембрану, лизируя клетки и высвобождая внутриклеточные нуклеиновые кислоты, или НК, и нуклеазы.

Хаотропные агенты в буфере денатурируют нуклеазы, предотвращая деградацию НК.

Добавьте магнитные частицы стекла или MGP — магнитные частицы с кремнеземным покрытием — и тщательно перемешайте.

Низкий pH буфера протонирует диоксид кремния, создавая положительный заряд на поверхности MGP.

Отрицательно заряженные NA электростатически связываются с заряженной поверхностью, образуя комплекс NA-MGP.

Под действием магнитного поля комплексы NA-MGP собираются сбоку от трубки.

Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую клеточный мусор и белки.

Выполните несколько этапов промывки, повторно суспендируя комплексы NA-MGP в промывном буфере, применяя магнитное поле для сбора комплексов и удаляя надосадочную жидкость с оставшимися загрязнениями.

Ресуспендируйте комплексы в буфере элюирования. Высокий pH нарушает взаимодействие NA-MGP, высвобождая NA. Элюированные NA готовы к последующим анализам.

Чтобы очистить собранную кровь от нуклеиновых кислот, снова перемешайте содержимое пробирки, перевернув вакуумную пробирку вручную от 5 до 10 раз. Налейте подготовленную аликвоту MGP непосредственно в пробирку для сбора крови, затем поместите новую крышку из неиспользованной пробирки для сбора крови на пробирку, содержащую образец. Положите палец на крышку, чтобы убедиться, что тюбик плотно закрыт, и перемешайте содержимое тюбика, перевернув от 5 до 10 раз.

Поместите трубку в магнитный держатель и держите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыта. Затем несколько раз переверните магнитный держатель с трубкой, чтобы рассеять MGP, прежде чем они соберутся на боковой стороне трубки с магнитом. Снимите крышку пробирки и выбросьте содержимое пробирки в 50-миллилитровую пробирку для сбора с помощью одноразовой пипетки.

Залейте подготовленную аликвоту WB1 непосредственно в пробирку для сбора крови, и закройте пробирку крышкой. Перемешайте содержимое вручную от 5 до 10 раз. Затем соберите шарики сбоку от трубки с помощью магнита и удалите жидкость, как и раньше. Снова суспензируйте бусины в подготовленной аликвоте WB2. Затем, выбросьте раствор, и повторите процедуру с приготовленной аликвотой WB3.

Наконец, извлеките пробирку из магнитного держателя и вылейте подготовленную аликвоту БЭ непосредственно в пробирку для сбора крови. Наденьте крышку на трубку и снова подвесьте MGP, постучав пальцем от 5 до 10 раз. Наконец, используйте одноразовую пипетку объемом 1,5 миллилитра для переноса одной капли ресуспендированных MGP в последующую реакционную смесь амплификации нуклеиновых кислот.