Визуализация формирования иммунологических синапсов NK-клеток на поддерживаемом липидном бислое со сверхвысоким разрешением

Приготовьте предметное стекло с липидным бислоем с поддержкой, или SLB, состоящим из фосфолипидов и биотинилированных фосфолипидов.

Добавьте блокирующие белки для предотвращения неспецифических взаимодействий.

Вводят стрептавидин, который связывается с биотинилированными фосфолипидами.

Добавьте биотинилированные флуоресцентно меченые анти-CD16 антитела, которые связываются с иммобилизованным стрептавидином.

Пипетка D-биотина для предотвращения неспецифического связывания стрептавидина с клетками.

Вводите естественные киллеры, или NK-клетки. Рецепторы CD16 на этих клетках специфически связываются с SLB-связанными анти-CD16 антителами, образуя иммунологический синапс.

Это связывание запускает перестройку актина и поляризацию микротрубочек, в конечном итоге образуя микрокластеры в центре синапсов, содержащие SLB-связанные анти-CD16 антитела и рецепторы CD16.

Литические гранулы, содержащие перфорин, поляризуются и проникают через актиновые филаменты в синапсе.

Закрепите клетки. Процедите мембраны и SLB.

Добавьте флуоресцентно меченные фаллоидин и антиперфориновые антитела, которые связываются с актиновыми филаментами и перфорином соответственно.

С помощью флуоресцентного микроскопа сверхвысокого разрешения визуализируйте распределение флуоресцентных актиновых филаментов и перфорин-положительных гранул в синапсе.

Чтобы собрать плоский липидный бислой на стеклянной основе, сначала приготовьте 100 миллилитров раствора пираньи, смешав 30% перекись водорода с серной кислотой в соотношении 1 к 3 в стакане. В этот раствор поместите два прямоугольных покровных стекла #1.5 на 20-30 минут. Во время очистки покровных стекол извлеките одну пробирку ранее подготовленных 400-микролярных липидов DOPC и одну пробирку ранее подготовленных 80-микролярных липидов Biotin-PE. Транспортируйте их на льду в аргоновый бак.

После дезоксигенации новой микроцентрифужной пробирки аргоном добавьте DOPC и Biotin-PE в соотношении 1 к 1. Конкретный объем будет варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей, но должен быть, как минимум, 2 микролитра каждый. Обескислите пробирку со смесью и отдельные пробирки с реагентом перед тем, как вернуть последнюю в холодильник.

После того, как они закончат чистку, тщательно промойте покровные стекла дистиллированной водой. Выложите покровные стекла для сушки на воздухе в течение нескольких минут. Затем извлеките 1,5 микролитра смеси липосом, и выделите ее одной каплей в одну из камер полосы камерного предметного стекла. Использование двух дропов на дорожку является типичным, но не обязательным.

Теперь быстро и качественно наложите сухой покровный лист на капли. Убедитесь, что капли расположены на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы они не слились после установки покровного стекла. Кроме того, следите за тем, чтобы капли оставались круглыми и четко очерченными, не касаясь краев стенок камеры. Плотно прижмите друг к другу между каждой полосой движения и вокруг нее, чтобы обеспечить водонепроницаемое уплотнение между покровным стеклом и ползуном.

Отметьте положение капель маркером. Затем пропустите 100 микролитров водного 5% казеина через камеру, чтобы заблокировать бислой. Постарайтесь убедиться в отсутствии пузырьков в проточной камере. Затем введите 100 микролитров стрептавидина в концентрации 333 нанограмма на миллилитр в каждую дорожку.

После инкубации в течение 10-15 минут при комнатной температуре промойте 3 миллилитра буферизованного HEPES физиологического раствора с 1% сывороточным альбумином человека через каждую дорожку, чтобы удалить избыток стрептавидина. Добавьте 100 микролитров биотинилированного, флуоресцентно меченного анти-CD16 в концентрации белка, определенной ранее, как описано в текстовом протоколе.

После инкубации в темноте в течение 20-30 минут снова промойте, пропустив 3 миллилитра буферизованного HEPES физиологического раствора с 1% сывороточным альбумином человека через каждую дорожку. Затем пропустите через камеру 100 микролитров D-биотина в концентрации 25 наномоляров, чтобы связать избыток стрептавидина и, таким образом, устранить вероятность неспецифического связывания стрептавидина с клетками.

Затем подсчитайте NK-клетки человека и ресуспендируйте их в концентрации 500 000 на миллилитр в буферизованном HEPES физрастворе с 1% сывороточного альбумина человека. Смойте D-биотин из камеры еще 3 миллилитрами HEPES-буферизованного физиологического раствора с 1% сывороточного альбумина человека на полосу. После того, как клетки будут повторно суспендированы в нужной концентрации, добавьте по 100 микролитров в каждую дорожку. Поместите камеру в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 30-60 минут.

По истечении этого инкубационного периода зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом при комнатной температуре на 10 – 20 минут. Промойте, пропустив 3 миллилитра фосфатно-солевого буфера через каждую дорожку, чтобы удалить параформальдегид. Затем добавьте 400 микролитров блокирующего буфера перед инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем окрашивают F-актин и перфорин, добавляя 200 микролитров разбавленного, флуоресцентно меченного фаллоидина и флуоресцентно меченного антиперфоринового моноклонального антитела. Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа перед промывкой, пропустив через камеру 3 миллилитра фосфатно-солевого буфера. Камера готова к визуализации.

Для начала включите все необходимые аппаратные модули микроскопа STED. Запустите программное обеспечение для анализа изображений и включите модули резонансного сканирования и STED. После выполнения этих действий подождите от трех до пяти минут, пока программное обеспечение не запустится.

Нажмите на вкладку «Конфигурация» в верхней части экрана. Выберите Laser Config (Конфигурация лазера). Затем включите белый свет и 592-нанометровые лазеры STED. Выберите объектив 100X и совместите луч возбуждающего лазера с лазером с 592 нанометровым истощением. Выберите модуль Laser Config. Выключите 592-й лазер истощения и включите 660-нанометровый лазер

Поместите слайд на сцену над объективом. Сфокусируйте клетки, связанные на отграниченной области бислоя, с помощью лампы белого света и окуляров. Затем вернитесь на вкладку «Приобретение» справа от вкладки «Конфигурация». Перейдите на вкладку Переключиться на белый свет, затем включите этот модуль и перетащите линию возбуждающего лазера на соответствующую длину волны.

После выбора нужного детектора и настройки дальности обнаружения нажмите кнопку «Последовательный» на левой панели инструментов «Захват», чтобы открыть диалоговое окно «Последовательное сканирование» в нижней части левой панели инструментов. Это позволяет пользователю добавлять несколько последовательностей, каждая из которых имеет свой возбуждающий луч для своего цвета. Кликайте между кадрами, а затем задайте частоту возбуждения, детектор и дальность обнаружения для каждого дополнительного цвета. После того, как все настройки будут оптимизированы, нажмите «Старт», чтобы начать процесс сбора.