Анализ цитотоксичности, опосредованный клетками-киллерами, подготовка образцов для проточного цитометрического анализа

Начните с клеточной гранулы, содержащей естественные киллеры или NK-клетки, а также флуоресцентно окрашенные клетки-мишени.

Повторно суспендируйте гранулу в подходящей среде и инкубируйте.

NK-клетка взаимодействует через поверхностные белки адгезии, образуя иммунологический синапс с клеткой-мишенью.

Это инициирует передачу сигналов NK-клеток, высвобождая цитотоксические гранулы, содержащие перфорин и гранзимы, в синапс.

Перфорин, белок, образующий поры, создает каналы в мембране клетки-мишени, позволяя гранзимам проникать в цитоплазму.

Гранзим, сериновая протеаза, взаимодействует с внутриклеточными белками, активируя путь апоптоза в клетке-мишени.

Теперь добавьте флуоресцентный краситель йодида пропидия.

Краситель проникает в мертвые клетки через их поврежденные мембраны и связывается с ДНК, интеркалируя между парами оснований.

Следовательно, мертвые клетки экспрессируют двойной флуорохром, в то время как живые клетки экспрессируют одинарный флуорохром.

Образец готов к проточной цитометрии для оценки цитотоксичности, индуцированной NK-клетками, путем количественного определения количества мертвых и живых клеток-мишеней.

Чтобы получить образец для анализа цитотоксичности, сначала пометьте 1,5-миллилитровые пробирки для каждого образца и/или участника, если это необходимо, и поместите пипетку с желаемым соотношением NK-клеток и меченных DiO клеток K562 в каждую пробирку.

Соберите клетки центрифугированием и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную смесь в 500 микролитрах неполной среды NK-клеток и пометьте клетки в каждой пробирке 5 микролитрами йодида пропидия.

Соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и инкубируйте холодную культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. В конце инкубации центрифугируйте клетки в тех же условиях центрифуги и повторно суспендируйте гранулу в 25 микролитрах свежей и полной среды для культивирования NK-клеток.