JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:26 мин • July 8th, 2025
Начните с резецированного человеческого легкого.
Вставьте силиконовую трубку в главный бронх легкого. Закрепите трубку, предусмотрев путь для введения агарозы в ткани на последующих этапах.
Зажмите другие бронхи и сосуды, чтобы предотвратить утечку агарозы во время наполнения.
Вводите в легкое предварительно подогретую маложелирующую агарозу, смешанную со средой, до полного его надувания.
Поместите легкое на лед для агарозной полимеризации, образуя твердую гелевую матрицу, которая обеспечивает стабильность ткани и поддерживает архитектуру легких во время процедур секционирования.
После полимеризации разрежьте легочную ткань на однородные пластины. Извлеките цилиндрические тканевые ядра из тканевых плит.
С помощью слайсера для тканей, наполненного охлажденным буфером, разрежьте ядро ткани, чтобы получить точно нарезанные срезы легких.
Переложите ломтики на культуральную пластину с охлажденной средой. Инкубируйте для стабилизации тканей.
Наконец, переложите ломтики в многолуночную пластину, содержащую среду. Подготовленные прецизионно нарезанные ломтики легких теперь готовы к экспериментам.
Чтобы начать эту процедуру, канюлируйте трахею, вставив силиконовую трубку и зафиксировав ее зажимом параллельно трубке так, чтобы зажим сжимал ткань вместе с силиконовой трубкой, не защемляя ее. Закройте все остальные бронхи, кровеносные сосуды и травмы зажимами, чтобы агароза не могла вытекать во время процедуры наполнения.
Хорошие анатомические навыки необходимы для канюлирования основного бронха. Легкие не должны быть расширены слишком сильно, иначе ткань будет отвлекать, и если ткань недостаточно заполнена, будет невозможно сделать какие-либо PCLS, потому что ткань слишком мягкая.
Затем смешайте эквивалентный объем 3% низкожелирующей агарозы с питательной средой в стакане и закапывайте смесь в легкое с помощью 50-миллилитрового шприца. Перед тем, как наполнить шприц медиумом, зажим закройте катетер пальцами или зажимом, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и флюса, не содержащего агарозы. Разрежьте легочную ткань на плиты от 3 до 5 сантиметров.
Наполните тканевый слайсер 400 миллилитрами ледяного EBSS. Сразу же вырежьте цилиндрические тканевые ядра из плит легких с помощью полуавтоматической отвертки с инструментом для отбора керна. После этого переложите ядра тканей в держатель для салфеток слайсера. Поместите груз на верхнюю часть тканевого ядра и начните нарезать тканевое ядро на PCLS. Среду следует слить из тканевого слайсера в стакан, открыв зажим стеклянного цилиндра.
Далее переложите ломтики из стакана в чашку Петри с питательной средой. После этого поместите чашку Петри в инкубатор и дайте среде нагреться перед этапами мытья. Затем осторожно переложите срезы легких в 24-луночный культуральный планшет с минимальным содержанием 500 микролитров питательной среды для двух срезов на лунку.