Оценка цитотоксичности и целостности мембраны в срезах легких с помощью анализа лактатдегидрогеназы

Начните с прецизионно вырезанных человеком ломтиков легких, PCLS, обработанных цитотоксическими агентами, такими как молекулы поверхностно-активных веществ, в многолуночном планшете.

Поверхностно-активное вещество встраивается в липидный бислой клетки, заставляя гидрофобные хвосты поверхностно-активного вещества взаимодействовать с гидрофобным ядром липидного бислоя.

В результате нарушается упорядоченное расположение молекул липидов, что приводит к образованию мицеллы.

Это нарушает целостность мембраны, вызывая утечку внутриклеточного содержимого, включая лактатдегидрогеназу или ЛДГ, распространенный показатель повреждения клеточной мембраны.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую выделяющийся ЛДГ.

Добавьте коктейль из реакции анализа ЛДГ, содержащий субстрат лактата, НАД+, поторазу и соль тетразолия, и инкубируйте.

ЛДГ окисляет лактат до пирувата, с одновременным восстановлением кофермента НАД+ до НАДН.

Diaphoraze использует NADH для восстановления соли тетразолия до формазана — окрашенного продукта.

Цитотоксичность, вызванная сурфактантом, может быть измерена по активности ЛДГ, на которую указывает продукция формазана.

После инкубации PCLS с тестирующими агентами или без них перенесите 50 микролитров надосадочной жидкости и дубликатов в новую 96-луночную пластину. При этом создаются дубликаты из каждой обработанной лунки 24-луночного планшета.

Непосредственно перед проведением анализа готовят мастер-смесь рабочего раствора реагента ЛДГ путем тщательного перемешивания 125 микролитров раствора катализатора с 6,25 миллилитрами раствора красителя для 96-луночного планшета. Затем пипеткой внесите 50 микролитров рабочего раствора мастер-микса в каждую лунку, уже содержащую 50 микролитров надосадочной жидкости, и выдержите пластину в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. После этого измерьте поглощение каждой лунки на глубине 492 нанометра с помощью считывателя микропланшетов и вычтите поглощение на глубине 630 нанометров из эталонной величины на глубине 492 нанометров.