Бактериальная культура фильтрует концентрацию белка с помощью ультрафильтрационного устройства

Возьмем центробежный фильтрующий аппарат большого объема, содержащий вертикальные регенерированные целлюлозные мембраны подходящего размера пор.

Добавьте буфер и центрифугу. Удалите проточный увлажнитель, содержащий мембрану.

Загрузите в устройство бактериальный культуральный фильтрат белок, или CFP, включающий растворимые белки и внеклеточные везикулы, или EV — наноразмерные липидные структуры, содержащие биомолекулы, секретируемые бактериями.

Во время центрифугирования CFP проходит по касательной через мембраны под действием центробежной силы.

Биомолекулы меньшего размера, чем поры мембраны, проходят через культуральную жидкость, в то время как более крупные, такие как EV, проходят по поверхности мембраны, сводя к минимуму засорение мембраны.

Фильтр концентрирует CFP в минимальном объеме устройства, чему способствует его мертвый объем для предотвращения высыхания биомолекул.

Добавьте буфер и центрифугу.

Буфер заменяет компоненты остаточной среды, создавая изотоническую среду для биомолекул CFP и сохраняя их целостность.

Поместите чашку для концентрата на чашку фильтра, переверните и центрифугуйте. Восстановите концентрированный ретентат CFP для дальнейшего анализа.

Для начала приготовьте центробежный фильтр с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон, добавив полную объемную емкость PBS. Центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 2800 раз больше g при 4 градусах Цельсия. Отбросьте проточный поток и остатки PBS и заполните пробоотборную камеру Mtb CFP до максимальной емкости. Центрифугируйте при температуре 2800 раз больше g при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства. При необходимости повторяйте до тех пор, пока весь образец не будет достаточно уменьшен.

Добавьте 1x PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите объем, как описано выше, и повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и замену буфера. Затем восстановите ретентат CFP с концентрацией 100 килодальтон, или 100R, в соответствии со спецификациями ультрафильтрационного устройства. Промойте фильтр с минимальным объемом 1x PBS не менее трех раз и потяните промывку с помощью 100R, чтобы максимизировать восстановление.