Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 2:24 мин. • July 8th, 2025
Возьмем личинку данио-рерио, которой ввели споры гриба в задний желудочек мозга.
Макрофаги рекрутируются в место инъекции, образуя плотный кластер вокруг спор.
Споры подвергаются фагоцитарному поглощению макрофагами.
Эти споры обладают способностью сопротивляться деградации внутри фагосомы, что позволяет им прорастать в гифы и индуцировать некротическую гибель клеток макрофага.
Гифы обладают открытыми патоген-ассоциированными молекулярными структурами, или PAMP, на своей поверхности.
Нейтрофилы, рекрутируемые в очаг инфекции, распознают и связывают PAMP. Контакт с нейтрофилами запускает сложный гиперветвящийся фенотип в гифах, тем самым препятствуя их поглощению нейтрофилами и способствуя уклонению от иммунитета.
Гомогенизируйте личинку, высвобождая жизнеспособные грибковые споры и гифы. Центрифуга для удаления клеточного мусора и нанесения надосадочной жидкости на питательную среду.
После инкубации подсчитайте грибковые колониеобразующие единицы или КОЕ.
Количество КОЕ представляет собой количество жизнеспособных грибковых спор, которые уклонились от иммунной защиты хозяина.
Сразу после инъекции перенесите восемь личинок в отдельные 1,7-миллилитровые трубки, и усыпьте их. Приготовьте по 1 миллилитру PBS с ампициллином и канамицином. Удалите как можно больше жидкости из пробирок с личинками. Затем добавьте 90 микролитров PBS с антибиотиками.
Гомогенизируйте личинки в тканевом лизоре со скоростью 1800 колебаний в минуту в течение 6 минут. Затем уменьшите их в 17 000 раз больше g в течение 30 секунд. Пипеткой нанесите гомогенизированную суспензию из каждой пробирки в середину маркированной пластины GMM и распределите ее с помощью одноразового L-образного распределителя, стараясь не растекаться по краю. Выдерживайте пластины вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2-3 дней. Затем подсчитайте количество образовавшихся колоний.