Метод zWEDGI для визуализации личинок рыбок данио, инфицированных грибковыми патогенами

Начните с трансгенных личинок данио-рерио, экспрессирующих флуоресцентно меченные иммунные клетки, помеченные уникальными флуоресцентными маркерами для точного отслеживания.

Личинкам предварительно вводят красный флуоресцентный белок, экспрессирующий споры Aspergillus, в задний мозг.

В заднем мозге грибковые споры имитируют местное воспаление и привлекают иммунные клетки, в том числе макрофаги, которые фагоцитируют споры для их выведения.

В то время как некоторые споры сохраняются и прорастают в гифы, высвобождая молекулы, полученные от патогена, и привлекая нейтрофилы к месту инфекции.

Перенесите личинку под наркозом в содержащую среду загрузочную камеру устройства для нанесения ран и захвата рыбок данио для роста и визуализации, или zWEDGI, подключенного к камере раны через канал ограничения.

Закрепите личинку в рестрикционном канале в дорсально-латеральной ориентации для визуализации заднего мозга.

На ранних стадиях красная флуоресценция представляет споры грибов, в то время как зеленая флуоресценция подтверждает рекрутирование макрофагов в очаг инфекции.

Со временем распространение красной флуоресценции указывает на прогрессирование инфекции, в то время как появление дополнительной синей флуоресценции указывает на рекрутирование нейтрофилов.

В день визуализации приготовьте одну 3,5-миллиметровую чашку Петри со 100 микромолярной ПТУ и одну с Е3-трикаином. Добавьте E3-трикаин в камеры устройства zWEDGI и используйте микропипетку P100 для удаления пузырьков воздуха из камер и ограничивающего канала, затем удалите весь избыток E3-трикаина за пределами камер.

Пипеткой наберите одну личинку и перенесите ее в чашку с помощью E3 PTU, затем переложите ее в E3-трикаин с как можно меньшим количеством жидкости. Через 30 секунд перенесите личинок под наркозом в загрузочную камеру устройства для ранения и захвата.

Извлеките Е3-трикаин из раневой камеры, и выпустите его в загрузочную камеру для того, чтобы переместить хвост личинок в рестрикционный канал. Убедитесь, что личинка расположена на латеральной, дорсальной или дорсолатеральной стороне, чтобы задний мозг можно было визуализировать с помощью перевернутой линзы объектива.

После визуализации личинки с помощью конфокального микроскопа выпустите E3-трикаин в раневую камеру, чтобы вытолкнуть личинку из удерживающего канала в загрузочную камеру. Возьмите личинку и перенесите ее обратно в чашку с E3-трикаином, затем перенесите ее в чашку с E3 PTU с как можно меньшим количеством жидкости. Промойте его в PTU и переложите обратно в 48-луночный планшет.