Анализ опсоно-адгезии для оценки опсонизации инкапсулированных бактерий антикапсульными антителами

Возьмем, к примеру, суспензию химически убитых, флуоресцентно меченых Bacillus anthracis.

Бактериальная капсула, состоящая в основном из полигамма-глутаминовой кислоты, обеспечивает защиту от фагоцитоза.

Возьмем сыворотки приматов, инактивированные при нагревании для разрушения белков комплемента. Эти сыворотки, выделенные от животных, иммунизированных вакциной на основе бактериальных капсул, содержат антикапсульные антитела.

Добавьте химически убитую бактериальную суспензию в сыворотку. Антитела специфически связываются с бактериальными капсулами, облегчая бактериальную опсонизацию и помечая их для элиминации фагоцитарными клетками. Добавьте стандартные белки комплемента для усиления опсонизации.

Перенос опсонизированных бактерий на адгезивные макрофаги — фагоцитарные клетки. Высиживайте недолго.

Антитела и белки комплемента на бактериях связываются с Fc-рецепторами макрофагов и рецепторами комплемента, соответственно, способствуя адгезии бактерий.

Удалите носитель. Промойте с буфером, чтобы удалить неприлипшие бактерии.

Зафиксируйте клетки, чтобы сохранить клеточную целостность.

Используйте флуоресцентный краситель для маркировки макрофагов.

С помощью флуоресцентного микроскопа наблюдайте за флуоресцентными бактериями, прилипшими к разнофлуоресцентным макрофагам, подтверждая эффективную опсонизацию бактерий антикапсульными антителами.

Промойте инактивированный бактериальный запас три раза в PBS для удаления фиксатора. Добавьте раствор FITC в конечной концентрации 75 мкг на миллилитр. Медленно перемешивайте смесь в течение 18-24 часов при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте бактерии, как и раньше, чтобы удалить излишки FITC.

После окончательной промывки повторно суспендируйте бациллы в PBS в том же стартовом объеме. Аликвотировать и хранить бациллы при температуре -20 градусов Цельсия до использования. Тепловая инактивация небольшого объема исследуемой сыворотки от нечеловекообразных приматов при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут в тепловом блоке или ПЦР-машине. Разморозьте и промойте бактерии, меченные FITC, PBS два раза, гранулируя в 15 000 раз г в течение трех-пяти минут. Повторная приостановка в PBS в том же стартовом объеме.

В 96-луночном планшете с круглым дном последовательно разбавляйте исследуемую сыворотку в клеточной среде. В другую 96-луночную пластину с круглым дном добавьте в каждую лунку по 10 микролитров разведенных тестовых сывороток. Затем добавьте 10 микролитров свежевосстановленного комплемента для крольчат.

К пластине номер три добавить соответствующий объем меченых FITC бацилл для кратности инфекции 20, например, при объеме, содержащем 50 000 умножить на 20 бацилл на 50 000 клеток. Долейте каждую лунку в тарелку номер три с соответствующим объемом клеточной среды в общей сложности 105 микролитров. Инкубируйте тарелку номер три при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут в присутствии 5% СО2 с влажностью для опсонизации бацилл.

Поместите пластину номер один, содержащую адгезивные клетки, на термоблок при температуре 37 градусов Цельсия. Используйте многоканальный дозатор для удаления отработанной среды из лунок и быстро замените его 100 микролитрами опсонизированных бактерий с планшета номер три, чтобы во время пипетирования в лунках не образовывались пузырьки. Чтобы не нарушить монослой ячейки, добавьте объем стенкам лунок.

Инкубируйте планшет номер один при температуре 37 градусов Цельсия с 5%_CO2 и влажностью в течение 30 минут для прилипания. Промойте каждую лунку пять раз 150 микролитрами PBS поверх нагревательного блока при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы удалить неприкрепленные бациллы. Проводите пипеткой сбоку от лунок, чтобы ячейки случайно не рассеялись во время промывки. Добавьте в каждую лунку по 150 микролитров 4% параформальдегида, и зафиксируйте клетки на один час.

После двукратной промывки клеток PBS смешайте два микролитра скринингового красителя для апельсиновых клеток с высоким содержанием скрининга в 10 миллилитрах PBS. Затем добавьте 150 микролитров этого окрашивающего раствора в неподвижные клетки и инкубируйте в течение 30 минут при температуре окружающей среды. Поместите пластину номер один на сцену и сосредоточьтесь на ячейках с помощью яркого поля или фазового контраста.

На вкладке Сбор данных выберите формат 96-луночных скважин в качестве параметра пластины, а затем выберите Настройки канала. Затем выберите Настройка в режим мозаики. Укажите количество изображений, которые необходимо получить. Измените режим сбора данных на черно-белый или монохромный и установите для биннинга значение не менее 2 на 2. Включите модуль автофокусировки или фокусировки. Укажите, как часто должна выполняться функция автофокусировки.

Далее включаем функцию z-стека, если таковая имеется, указываем количество z-стеков, которые будут захватывать толщину монослоя ячейки и адгезивных бацилл. Назначьте папку с файлами для сохранения изображений. Теперь запустите программу автоматической обработки изображений. Выполнение сбора и анализа данных, как описано в текстовом протоколе.