Оценка топологии иммунологических синапсов с помощью визуализации живых клеток

Возьмем чашку для микроскопа с буфером, содержащим трансфицированные, обработанные суперантигенами эндотелиальные клетки человека, причем суперантигены объединены с молекулами MHC класса II.

Эти искусственные антигенпрезентирующие клетки совместно экспрессируют различные флуоресцентные белки на своих мембранах и цитоплазме.

Затем вводят Т-лимфоциты, которые взаимодействуют с суперантигенами на эндотелиальных клетках через Т-клеточные рецепторы, образуя стабильное межклеточное соединение, иммунологический синапс.

Это вызывает перестройку цитоскелета Т-лимфоцитов, инициируя распространение клеток и удлинение актина, что приводит к образованию инвадосомоподобных выступов, или ILP, обогащенных актином, адгезией и сигнальными молекулами.

Молекулы адгезии связывают специфические рецепторы на эндотелиальных клетках, усиливая взаимодействие.

Образование синапсов активирует сигнальные пути Т-лимфоцитов, повышая внутриклеточный уровень кальция и стабилизируя ILP.

ILP индуцируют локализованный изгиб мембраны в эндотелиальных клетках, образуя переходные поверхностные кольца.

Под флуоресцентным микроскопом проанализировать топологию синапсов, включающую темные круглые зоны смещения флуоресцентной цитоплазмы в эндотелиальной клетке, кололокализованные с различными флуоресцентными мембранными кольцами вокруг ILP, подтверждающие формирование иммунологических синапсов.

Чтобы получить изображение клеток в режиме реального времени, включите систему микроскопа и откройте соответствующее программное обеспечение для захвата изображений. Установите соответствующие параметры для автоматизированной многоканальной цейтраферной съемки, а также интервал для сбора данных от 10 до 30 секунд и общую продолжительность примерно от 20 до 60 минут.

Далее добавьте свежее масло в цель. Установите чашку для микроскопа, содержащую 0,5 миллилитра буфера А, на адаптер нагревательного столика и немедленно включите адаптер, предварительно установленный на 37 градусов Цельсия. После двух-трех минут равновесия с помощью пипетки объемом 20 микролитров добавьте остатки лимфоцитов, загруженных Fura-2, в установленную камеру микроскопа и включите светлую визуализацию.

Выберите путь света к окулярам и с помощью ручки грубой фокусировки приблизьте объектив к дну чашки микроскопа. Затем с помощью окуляра и ручки точной фокусировки найдите Т-клетки, расположенные на дне чашки, и с помощью элементов управления XY stage выберите поле, содержащее не менее 10 ячеек.

Когда соответствующие ячейки будут расположены, переключитесь со светлого поля на источник флуоресцентного света, а также с окулярного изображения на ПЗС-камеру. Оптимизируйте параметры съемки, а затем получите снимки Fura2-340 и Fura2-380 в состоянии покоя.

Одним из ключевых шагов на пути к получению успешных результатов является тщательная оптимизация параметров регистрации флуоресценции, обеспечивающая сбор достаточного сигнала и, в случае Fura-2, близкое к 1 базовому соотношению 340/380.

Когда время воздействия Fura-2 установлено, замените чашку с Т-клетками на чашку для микроскопа с эндотелиальными клетками. С помощью одноразовой переводной пипетки быстро удалите среду, и промойте ячейки один раз 1 миллилитром предварительно подогретого буфера А, затем замените промывку на 0,5 миллилитра свежего буфера А.

Используя эту цель, определить поля, в которых ярко флуоресцентные эндотелиальные клетки выглядят здоровыми, затем отрегулировать параметры регистрации для membrane-YFP и DsRed, как только что было продемонстрировано для Fura-2, следя за тем, чтобы средняя интенсивность флуоресцентного сигнала в каждом канале находилась в диапазоне от 25% до 75% динамического диапазона детектора.

Перед проведением эксперимента по визуализации живых клеток сделайте несколько интервалов изображений эндотелиальных клеток, чтобы установить исходный уровень с помощью автоматизированного программного обеспечения. Затем, вставив кончик пипетки небольшого объема в среду, расположенную близко к центру объектива, медленно дозируйте 5 микролитров концентрированных лимфоцитов, загруженных Фура-2, в центр поля визуализации микроскопа.

По мере того, как лимфоциты оседают, вносите тонкие корректировки в фокус, чтобы обеспечить сохранение границ раздела Т-клеток/эндотелиальных клеток в фокальной плоскости. При использовании объективов 40x и 63x оптимальным является от 10 до 20 ячеек на поле.