Метод иммунофлуоресцентной локализации in vivo для изучения биораспределения антител

Возьмем мышиную модель рака молочной железы. Опухоли молочных желез включают раковые клетки, ассоциированные с раком фибробласты, адипоциты, иммунные клетки и опухолевую сосудистую сеть.

Внутривенно ввести флуорофор-конъюгированные опухолеспецифические антитела.

Достигая сосудистой сети опухоли, антитела связываются с опухолеспецифичными трансмембранными белками на эндотелии сосуда и близлежащих раковых клетках.

Хирургическим путем изолируйте молочную железу и погрузите ее в замораживающую среду.

Получить криорезы на предметном стекле и промыть с помощью буфера для удаления замораживающей среды.

Зафиксируйте срезы, чтобы сохранить архитектуру тканей. Нанесите моющее средство для усиления иммуноокрашивания и блокирующий раствор для предотвращения связывания неспецифических антител.

Введите первичное антитело, специфичное для молекул адгезии на эндотелии кровеносного сосуда, и вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором, которое связывается с первичным антителом, мечая сосудистую сеть.

Добавьте монтажный материал на предметное стекло и установите покровное стекло.

Под конфокальным микроскопом оцените биораспределение опухолеспецифических антител внутри и вокруг флуоресцентно меченой сосудистой сети опухоли.

После обезболивания, как описано в текстовом протоколе, подготовьтесь к инокуляции растворов антител в хвостовую вену. Продезинфицируйте хвост животного, трижды протерев спиртовой салфеткой. Расширить хвостовые вены, прогрев грелкой в течение примерно 30 секунд; Избегайте нагрева всего животного. С помощью катетера для хвостовых лопастей 27-го калибра введите иглу-бабочку в одну из двух боковых хвостовых вен.

Визуализируйте обратный поток крови в катетер, чтобы убедиться, что игла размещена правильно, чтобы растворы полностью проникли в животное, а не попали в хвост.

С помощью кусочка хирургической ленты аккуратно зафиксируйте хвост с введенной иглой к сцене. Промойте катетер 25 микролитрами стерильного фосфатно-солевого буфера. Затем введите раствор антитела в катетер с помощью инсулиновых шприцев. Промойте катетер еще раз 25 микролитрами стерильного PBS. Извлеките иглу из хвоста и надавите, чтобы остановить кровотечение.

Проведите гуманную эвтаназию мыши, как описано в текстовом протоколе, и уложите мышь в лежачее положение. С помощью хирургических ножниц и щипцов иссекайте опухолевые ткани. С помощью щипцов захватите только внешний слой кожи между набором молочных желез, ближайших к хвосту, и сделайте небольшой разрез хирургическими ножницами. Введите закрытые ножницы в разрез и медленно раскройте кончик, чтобы осторожно отделить кожу от подлежащей мембраны брюшной стенки, сохраняя ее неповрежденной.

Сделайте вертикальный разрез вверх по животу, продолжая отделять кожу от внутренней оболочки. Между третьей и четвертой молочными железами сделайте горизонтальный разрез поперек живота, чтобы обеспечить втягивание кожи и визуализацию молочных желез. Захватывая каждую опухоль или нормальную железу щипцами, аккуратно срезайте прикрепленную кожу с помощью хирургических ножниц.

Поместите вырезанные ткани в формы для одноразовой основы ткани, которые предварительно маркированы и заполнены средой для встраивания с оптимальной температурой резки. Быстро заморозьте формочки, поместив их на сухой лед. Чтобы изучить нецелевую доставку, иссекайте другие ткани или органы, представляющие интерес. С помощью криостата разрежьте замороженные блоки тканей толщиной 10 микрон и поместите соседние срезы на предварительно маркированные стекла адгезионного стекла.

Прополощите замороженные салфетки ПБС комнатной температуры в течение 5 минут, чтобы удалить закладывающую среду. Разграничьте срезы тканей с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы уменьшить объем растворов, необходимых во время окрашивания. Зафиксируйте срезы тканей 4% раствором параформальдегида на 5 минут. После промывания предметных стекол в PBS в течение 5 минут пропитайте срезы тканей 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 минут. Снова промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут.

Блокируйте ткани PBS, содержащим 3% массы на объем бычьей сыворотки и 5% объема козьей сыворотки на 1 час при комнатной температуре. После промывки предметных стекол в PBS в течение 5 минут инкубируйте срезы с первичными антителами, такими как общий ядерный, сосудистый или цитоплазматический маркер. Здесь используется крысиный антимышиный CD31 в разведении от 1 до 100 в блокирующем растворе. Предметные стекла с первичными антителами оставляют на ночь при температуре 4 градуса Цельсия, защищенные от обезвоживания, на лотке для предметных стекол.

После инкубации промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут три раза. Каждый раз меняйте PBS. Инкубируйте предметные стекла со вторичными антителами, чтобы пометить первичные антитела. Для этого применения визуализируйте антитело против B7-H3 с использованием конъюгированного антитела к козе AlexaFluor-546 против кролика, а визуализируйте CD31 с помощью вторичного антитела против крысы AlexaFluor-488 козы в блокирующем растворе. Защитите слайды от света и обезвоживания на лотке для слайдов в течение 1 часа при комнатной температуре.

После промывки стекол в PBS, как и раньше, нанесите одну каплю монтажного средства в центр среза ткани. Осторожно размещайте покровное стекло, не допуская попадания пузырьков воздуха. Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей и дайте высохнуть. Проведите конфокальную микроскопию и количественный анализ изображений, как описано в текстовом протоколе.