Мультиплексный иммуноферментный анализ на основе гранул для выявления патоген-специфических антител в слюне

Возьмите смесь из разных наборов микросфер — или полистирольных шариков микронного размера.

Каждый набор связан с уникальным антигеном из патогена окружающей среды и имеет уникальную флуоресцентную метку.

Добавьте смесь в фильтрующую пластину, содержащую мембрану на дне.

Ввести человеческую слюну, содержащую антитела против патогенов окружающей среды, которые связываются с родственными антигенами на микросферах.

Удалите несвязанные антитела с помощью вакуума. Связанные с микросферами антитела сохраняются благодаря малому размеру пор мембраны.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела для связывания с антителами, связанными с микросферой. Удалите несвязанные антитела.

Добавьте стрептавидин, конъюгированный с флуоресцентным репортерным красителем, который связывается с биотином на вторичных антителах.

Удалите несвязанный краситель, ресуспендируйте микросферы и пропустите их через мультиплексный иммуноферментный анализатор.

Лазерный луч обнаруживает флуоресценцию микросферы, идентифицируя антиген, в то время как другой луч обнаруживает репортерный сигнал, подтверждая наличие связанного антитела.

Антигенспецифические антитела в слюне указывают на предшествующий контакт с соответствующими возбудителями.

После ресуспендирования антиген-сопряженных бусин путем вортексирования и ультразвука в течение 20 секунд разбавьте сопряженные бусины до конечной концентрации 100 бусин на микролитр каждого уникального набора бусин в PBS плюс BSA. Затем приготовьте разведение слюны комнатной температуры в PBS плюс BSA в 96-луночном глубоком планшете. Предварительно смочите фильтрующую пластину 100 микролитрами промывочного буфера, и отасуньте надосадочную жидкость.

Затем добавьте 50 микролитров гранул, связанных с антигеном, и равный объем разбавленной слюны в 95 лунок фильтрующей пластины на 96 лунок для окончательного разведения от одного до восьми. В то же время добавьте в контрольную лунку 50 микролитров гранул, связанных с антигеном, плюс 50 микролитров PBS плюс только BSA.

Инкубируйте бусины в темноте при комнатной температуре в течение часа на вибростенде для микропланшетов при 500 об/мин. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и промойте лунки два раза 100 микролитрами промывочного буфера. После второй промывки суспендируйте шарики в 50 микролитрах PBS плюс BSA, разведите вторичное антитело и добавьте его по 50 микролитров в каждую лунку.

Перемешав содержимое лунки многоканальной пипеткой, выдержать пластину на шейкере в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем дважды промойте лунки 100 микролитрами буфера для промывки и повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах свежего PBS плюс BSA.

Теперь разведите репортер и добавьте по 50 микролитров в каждую лунку. Тщательно перемешайте с помощью многоканальной пипетки. Через 30 минут при комнатной температуре на шейкере в темное время суток промойте лунки два раза, как показано на рисунке. Затем повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах PBS плюс BSA и оцените образцы на анализаторе.