Иммунофлуоресцентный анализ для характеристики и количественного определения стрессовых гранул млекопитающих

Возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивные клетки остеосаркомы, на покровных стеколах.

Эти клетки рака костей предварительно обрабатываются химическим веществом, вызывающим стресс, что приводит к образованию стрессовых гранул.

Стрессовые гранулы представляют собой органеллы без цитоплазматической мембраны, содержащие нетрансляционные мРНК, малые рибосомные субъединицы, РНК-связывающие белки или RBP, факторы, связанные с трансляцией, и сигнальные белки.

Выбросьте носитель и промойте ячейки буфером. Зафиксируйте клетки, чтобы сохранить клеточную морфологию.

Проникайте в клетки для доступа к внутриклеточным мишеням. Добавьте блокирующие белки для предотвращения связывания неспецифических антител.

Вводите первичные антитела, которые связываются со специфическими RBP и факторами, связанными с трансляцией, в гранулы стресса.

Инкубируйте с различными вторичными антителами, меченными флуорофорами, и красителем Hoechst.

Вторичные антитела связываются с первичными антителами, связанными с белками, связанными со стрессовыми гранулами, в то время как молекулы Хёхста окрашивают ДНК.

Установите покровные крышки, содержащие ячейки, с помощью монтажного материала.

Используя флуоресцентн