Иммунофлуоресцентный анализ для характеристики и количественного определения стрессовых гранул млекопитающих

Возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивные клетки остеосаркомы, на покровных стеколах.

Эти клетки рака костей предварительно обрабатываются химическим веществом, вызывающим стресс, что приводит к образованию стрессовых гранул.

Стрессовые гранулы представляют собой органеллы без цитоплазматической мембраны, содержащие нетрансляционные мРНК, малые рибосомные субъединицы, РНК-связывающие белки или RBP, факторы, связанные с трансляцией, и сигнальные белки.

Выбросьте носитель и промойте ячейки буфером. Зафиксируйте клетки, чтобы сохранить клеточную морфологию.

Проникайте в клетки для доступа к внутриклеточным мишеням. Добавьте блокирующие белки для предотвращения связывания неспецифических антител.

Вводите первичные антитела, которые связываются со специфическими RBP и факторами, связанными с трансляцией, в гранулы стресса.

Инкубируйте с различными вторичными антителами, меченными флуорофорами, и красителем Hoechst.

Вторичные антитела связываются с первичными антителами, связанными с белками, связанными со стрессовыми гранулами, в то время как молекулы Хёхста окрашивают ДНК.

Установите покровные крышки, содержащие ячейки, с помощью монтажного материала.

Используя флуоресцентный микроскоп, наблюдайте за клетками, чтобы визуализировать и количественно оценить стрессовые гранулы, которые выглядят как флуоресцентные очаги, характеризующиеся колокализацией ассоциированных белков.

Чтобы закрепить клетки, удалите среду из лунок и промойте ячейки примерно 250 микролитрами PBS. Добавьте примерно 250 микролитров буферного 4% раствора параформальдегида для фиксации клеток, убедившись, что верхняя часть покровного стекла полностью покрыта. Затем оставьте тарелку на скамейке-качалке при комнатной температуре на 15 минут. Далее удалите и правильно выбросьте параформальдегид.

Добавьте примерно 250 микролитров ледяного метанола, чтобы проникнуть и сплющить клетки. Выдержите пластину еще 5 минут при комнатной температуре на коромысле. Как только пермеабилизация будет завершена, выбросьте метанол и заблокируйте клетки, введя примерно 250 микролитров блокирующего буфера в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем приготовьте первичный раствор антитела, добавив 12 микролитров антител против G3BP1, eIF4G и eIF3b к 3 миллилитрам блокирующего буфера.

Добавьте по 250 микролитров раствора антитела в каждую лунку 24-луночного планшета. Выдержите пластину на коромысле не менее 1 часа при комнатной температуре. Через 1 час инкубации удалите раствор антител и промойте клетки примерно 250 микролитрами PBS в течение 5 минут. Затем добавьте 12 микролитров антител против мыши Cy2, против кролика Cy3 и против козы Cy5 вместе с 3 микролитрами красителя Hoechst к 3 миллилитрам блокирующего буфера для приготовления вторичного раствора антитела.

Добавьте по 250 микролитров раствора вторичного антитела в каждую лунку и накройте пластину, чтобы защитить образцы от света. Выдержите тарелку на коромысле при комнатной температуре в течение 1 часа. Когда инкубация будет завершена, удалите раствор антител, и промойте клетки PBS в течение 5 минут. Нагрейте монтажный материал в термоблок при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут для снижения вязкости. Затем с помощью предварительно отрезанного наконечника для пипетки объемом 200 микролитров поместите 25 микролитров монтажной среды на предметное стекло с маркировкой.

С помощью тонких щипцов перенесите покровное стекло из лунки на предметное стекло, перевернув верхнюю часть так, чтобы клетки были обращены к монтажной среде. Используйте чистый наконечник P200, чтобы прижать покровное стекло. После того, как все покровные стекла будут установлены, удалите излишки монтажной среды, плотно прижав лабораторную салфетку к предметному стеколу. После этого промойте предметное стекло водой и сразу же промокните его лабораторной салфеткой еще раз.