Количественная оценка уровней иммунных медиаторов в слизистой оболочке человека

Разморозьте фильтровальную бумагу, содержащую впитавшуюся жидкость слизистой оболочки носа, на льду, чтобы предотвратить деградацию образца.

Жидкость содержит иммунные медиаторы, в том числе хемокины и цитокины.

Погрузите фильтровальную бумагу в буфер. Переложите содержимое в трубчатые фильтры. Центрифуга для вымывания слизистой жидкости от фильтровальной бумаги.

Добавьте отфильтрованный экстракт носа в пластину для анализа, покрытую массивом антител захвата, специфичных для медиатора.

Иммунные медиаторы связываются с соответствующими антителами.

Введите антитела для обнаружения, меченные рутениевым комплексом, которые связываются с соответствующими медиаторами.

Добавьте буфер на основе триса, содержащий трипропиламин, или ТФК.

Когда потенциал прикладывается к электродам, рутениевый комплекс и ТФК подвергаются окислению.

Образующийся радикал ТФК возбуждает рутениевый комплекс.

Возвращаясь в основное состояние, рутениевый комплекс испускает фотоны.

Измеряемая интенсивность света пропорциональна концентрации специфического иммунного медиатора в слизистой жидкости.

Для количественного определения иммунного медиатора дыхательных путей поместите на лед до 10 образцов из хранилища с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия и запишите их идентификационные номера. Когда образцы оттают, погрузите обе фильтровальные бумаги для каждого субъекта в 150 микролитров свежеприготовленного буфера на фильтровальную бумагу.

Дополните его одной таблеткой полного ингибитора протеазы на 25 миллилитров буферного раствора. Переложите образцы в шейкер для тарелок со скоростью 400 об/мин в течение 5 минут. Переложите буферную и фильтровальную бумагу в чашки отдельных трубчатых фильтров из ацетата целлюлозы.

Центрифугируйте образцы, чтобы собрать отфильтрованный назальный экстракт на дно микроцентрифужных пробирок. Затем снимите чашки и поместите трубки на лед. Затем перелейте 150-микролитровые аликвоты назального экстракта в отдельные лунки с пластинами для хранения с низким содержанием белка и храните пластины при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа. Затем измерьте концентрацию интересующих вас назальных иммунных медиаторов с помощью высокочувствительной мультиплексной матрицы на основе электрохемилюминесценции в соответствии со стандартными протоколами анализа.