Анализ расщепления флюорогенных пептидов для скрининга протеолитической активности протеаз

Оболочечные вирусы с трансмембранными шиповидными белками содержат сайт протеолитического расщепления.

Мембраносвязанные протеазы на клетках хозяина расщепляют шиповидные белки, обнажая гибридные пептиды, которые облегчают проникновение вируса.

Для начала возьмите пептиды дикого типа с каноническим сайтом расщепления и вариантные пептиды, каждый из которых несет уникальную мутацию в этом центре.

Флюорогенные пептиды содержат флуорофор и гаситель. Из-за близости гаситель поглощает флуоресценцию флуорофора.

Возьмите на лед многолуночный планшет, содержащий буфер для анализа и протеазы хозяина.

Добавьте пептиды дикого типа и варианта в отдельные лунки. Инкубируйте при подходящей температуре для оптимальной активности протеазы.

Протеаза расщепляет пептиды, отделяя гаситель от флуорофора и обеспечивая его флуоресцентное излучение.

Измерьте изменение сигнала флуоресценции, чтобы определить скорость протеолитического расщепления.

Более высокая скорость для последовательности дикого типа указывает на более высокую протеолитическую активность, в то время как более низкая скорость для вариантов указывает на измененную эффективность расщепления.

Подготовьте соответствующие буферы для анализа