Мониторинг поступления помеченных GFP поверхностных белков в сеть Транс-Гольджи с использованием функционализированных нанотел

Начните с лишенных сульфатов раковых клеток, экспрессирующих поверхностный белок, меченный GFP.

Добавьте меченый радиоактивными веществами сульфат и модифицированные нанотела против GFP — одноцепочечное антитело, несущее тирозин-сульфатионный мотив, и инкубируйте.

Клетки, лишенные сульфатов, интернализуют радиоактивно меченые сульфаты, включая их в клеточные компоненты.

Нанотело против GFP связывается с поверхностным белком, помеченным GFP, и эндоцитозируется в везикулу. Этот везикула транспортирует белковый комплекс нанотела-поверхности по определенным внутриклеточным путям, включая транс-сеть Гольджи, или TGN.

В ТГН сульфотрансфераза в присутствии субстрата переносит радиоактивный сульфат к специфическим остаткам тирозина на нанотеле, тем самым нанося ему радиоактивное пометку.

Промойте клетки. Далее лизируют клетки.

Центрифугируйте лизат для удаления крупного клеточного мусора. Выделите нанотела с помощью метода очистки на основе никелевых шариков.

Загрузите выделенную фракцию в гель SDS-PAGE, чтобы разделить меченое радиоактивным нанотелом на отдельные полосы.

Подвергнуть гель авторадиографии.

Полученная авторентгенограмма показывает затемненные участки, указывающие на присутст