Анализ для количественной оценки антителоопосредованного фагоцитоза инфицированных паразитами эритроцитов

Возьмем, к примеру, эритроциты, инфицированные Plasmodium falciparum. Пометьте ДНК паразита флуоресцентным красителем для визуализации паразита.

Инкубируйте эти зараженные паразитами эритроциты с сыворотками от лиц, подвергшихся воздействию малярии. Эти клетки отображают на своей поверхности антигены паразитов, которые прикрепляются к естественно приобретенным антителам IgG человека в сыворотках, опсонизируя клетки для фагоцитоза.

Перенесите эритроциты, инфицированные опсонизированными паразитами, в покрытую белком многолуночную пластину, содержащую суспензию моноцитов человеческого происхождения — или фагоцитарных клеток.

Во время инкубации Fc-гамма-рецепторы на моноцитах взаимодействуют с IgG-опсонизированными эритроцитами, вызывая поглощение эритроцитов в фагосомы.

После инкубации центрифугируйте планшет, чтобы предотвратить дальнейшие клеточные взаимодействия и остановить фагоцитоз.

Выбросьте надосадочную жидкость. Обрабатывают лизирующим раствором хлорида аммония, избирательно разрывая нефагоцитированные инфицированные эритроциты, не затрагивая моноциты.

Добавьте буфер, содержащий сыворотку, чтобы остановить процесс лизирования. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, содержащую лизированные эритроциты.

Ресуспендируйте моноциты в буфере.

Проведите проточную цитометрию для количественного определения моноцитов, которые проявляют флуоресценцию от инфицированных паразитами эритроцитов внутри них, подтверждая их фагоцитоз, опосредованный антителами.

Очищенную суспензию инфицированных эритроцитов доводят в 3,3 раза по 10 до 7-х клеток на миллилитр в культуральной среде паразита, содержащей бромид этидия, до конечной концентрации 2,5 мкг на миллилитр. Затем извлеките блокирующий раствор из одной 96-луночной пластины, бросив пластину в контейнер для отходов. Затем удалите излишки с бумажного полотенца и добавьте 30 микролитров суспензии зараженных эритроцитов меткой бромида этидия во все лунки, кроме одной в верхней половине пластины. Добавьте в пустую лунку 30 микролитров среды для культуры паразитов, и выдержите тарелку в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенной от света.

В конце инкубации добавьте в каждую лунку по 170 микролитров среды для культуры паразитов, а зараженные эритроциты осадите на дно планшета методом центрифугирования. Удалите надосадочную жидкость, бросив планшет в контейнер для отходов, и промойте инфицированные эритроциты, меченные бромидом этидия, еще два раза 200 микролитрами среды для культивирования паразитов на лунку, как показано выше.

После второй промывки с помощью многоканальной пипетки осторожно удалить весь объем надосадочной жидкости из каждой лунки, не нарушая гранулы, и повторно суспендировать меченные бромидом этидия инфицированные эритроциты в 30 мкл раствора антител, включая соответствующие контрольные и тестовые образцы, предварительно подготовленные в среде культуры паразитов. Затем поместите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на 45 минут, защищенную от света.

В то время как инфицированные эритроциты подвергаются опсонизации, соберите клетки THP-1 центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах свежей предварительно подогретой среды для культивирования клеток THP-1.

После повторного центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре среды для культуры клеток THP-1 для подсчета и отрегулируйте концентрацию клеток до 5 раз по 10 до 5-й клетки на миллилитр в среде для культивирования клеток THP-1. Удалите блокирующий раствор со второго 96-луночного планшета и добавьте по 100 микролитров клеток THP-1 в каждую лунку. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур.

В конце инкубации опсонизации добавьте по 170 микролитров питательной среды паразитов в каждую лунку опсонизационной пластины и осадите инфицированные эритроциты на дно пластины методом центрифугирования. Опсонизированные, инфицированные эритроциты промывайте два раза 200 микролитрами питательной среды паразитов на лунку с помощью многоканальной пипетки, чтобы осторожно удалить надосадочную жидкость после второго промывания.

Ресуспендируйте опсонизированные, инфицированные эритроциты в 100 микролитрах предварительно подогретой среды для культивирования клеток THP-1 на лунку и перенесите по 50 микролитров каждой опсонизированной, инфицированной суспензии эритроцитов в соответствующую лунку в планшете для фагоцитоза. Когда все клетки будут добавлены, поместите планшет в инкубатор для клеточных культур не более чем на 40 минут, защищенный от света.

По окончании инкубации остановите фагоцитоз центрифугированием при температуре 4 градуса Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы 150 микролитрами лизирующего раствора хлорида аммония комнатной температуры на лунку. Ровно через три минуты добавьте 100 микролитров ледяного 2% FBS в PBS, чтобы остановить лизис, и осадите неповрежденные клетки путем центрифугирования.

Далее промойте клетки три раза 200 микролитрами свежего ледяного 2% FBS в PBS, на лунку, на одну промывку. После окончательной промывки повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах свежего ледяного 2% FBS в PBS на лунку.

Для получения и анализа проточной цитометрии немедленно загрузите клетки в проточный цитометр и используйте линейную прямую и линейную диаграмму бокового рассеяния для лунок без инфицированных эритроцитов для гейтирования клеток THP-1. Получите 10 000 событий в этом затворе и используйте клетки THP-1 с инфицированными эритроцитами, опсонизированными с положительным контролем, чтобы построить гистограмму для измерения интенсивности флуоресценции бромида этидия.

Для анализа откройте график линейного прямого и линейного бокового рассеяния для лунок без инфицированных эритроцитов и затворите клетки THP-1. Затем установите положительный вентиль на гистограмме FL3 и скопируйте эти вентили на все остальные лунки образца, чтобы определить процент метидиевых бромид-положительных клеток THP-1.