Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 2:59 мин. • July 8th, 2025
Возьмите микропланшет, содержащий нейтрофильные сериновые протеазы или NSP. Эти растворимые ферменты с протеолитической активностью, секретируемые нейтрофилами, участвуют в воспалительных реакциях.
Добавьте флуоресцентные репортерные зонды с мотивом распознавания, который действует как сайт расщепления для NSP. Зонды конъюгированы с донором и акцепторным флуорофором.
При возбуждении определенной длиной волны донорный флуорофор излучает энергию. Благодаря близости к донору, акцепторный флуорофор поглощает энергию и излучает флуоресценцию различной длины волны.
Обнаруживайте сигналы донора и акцептора по отдельности и вычисляйте соотношение доноров и акцепторов для оценки активности NSP. Низкое соотношение свидетельствует о гашении донорной флуоресценции при отсутствии расщепления зонда.
NSP распознают и расщепляют мотив распознавания на зондах, освобождая акцептор.
Расстояние от акцептора обеспечивает флуоресцентное излучение от донорского флуорофора, увеличивая соотношение доноров и акцепторов. Высокий коэффициент указывает на эффективное расщепление зонда NSP.
Разморозьте ферменты на льду и установите стандартную кривую ферментов, как описано в рукописи текста. Параллельно со стандартным препаратом развести образцы мокроты в активационном буфере. На планшетном считывателе установите длину волны возбуждения для зонда NEmo-1 NEmo-1 равной 354 нанометра, а длину волны излучения — 400 нанометров для донора и 490 нанометров для акцептора.
Для зонда CG FRET sSAM установите длину волны возбуждения равной 405 нм, а излучение — 485 нм для донора и 580 нм для акцептора. Добавьте 40 микролитров образцов, стандартов или заготовок в лунки 96-луночной пластины Блэка с половиной площади и добавьте мастер-смесь.
Запустите считыватель пластин и записывайте увеличение соотношения доноров и акцепторов каждые 60-90 секунд в течение как минимум 20 минут или до тех пор, пока увеличение сигнала не достигнет плато. Экспортируйте данные и рассчитайте соотношение доноров и акцепторов, разделив донорский RFU на акцепторный RFU для каждой временной точки и выборки. Затем рассчитайте среднее значение соотношения донора к акцептору и стандартное отклонение. Определите наклон в пределах линейного роста изменения отношения донора к акцептору.