$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
К образцу цельной крови добавьте специфические комплексы антител, направленные против клеток крови, кроме нейтрофилов.
Добавьте магнитные частицы, которые связываются с антителами, связанными с комплексом клеток крови.
Перенесите иммуномагнитно помеченный образец в порт загрузки клеток микрофлюидного чипа.
Подключите магнитные диски к порту загрузки ячеек.
Магнитное поле притягивает иммуномагнитно помеченные клетки, захватывая их к боковым стенкам порта.
Нейтрофилы, будучи непомеченными, попадают в чип и попадают в ловушку в зоне стыковки клеток.
Добавьте флуоресцентно меченный раствор хемоаттрактанта и миграционную среду в предназначенные резервуары. Жидкости протекают по микрофлюидным каналам, образуя градиент концентрации.
Когда хемоаттрактант связывается с рецептором нейтрофилов, он вызывает внутриклеточные изменения, заставляя нейтрофилы реорганизовывать свой цитоскелет и удлинять псевдоподы.
Эти псевдоподы действуют как ноги, подталкивая нейтрофилы к более высоким концентрациям хемоаттрактанта — процесс, называемый хемотаксисом.
Используйте соответствующие методы микроскопии для мониторинга миграции нейтрофилов в ответ на градиент хемоаттрактанта.
Удалите деионизированную воду из устройства, и добавьте 100 микролитров раствора фибронектина из розетки. Подождите три минуты, чтобы убедиться, что все каналы заполнены раствором фибронектина. Затем инкубируйте устройство в закрытой чашке Петри в течение часа при комнатной температуре.
Далее извлеките раствор Фибронектина из прибора, и добавьте 100 микролитров миграционной среды из розетки. Опять же, подождите три минуты, чтобы убедиться, что все каналы заполнены средой миграции. Инкубируйте устройство еще в течение часа при комнатной температуре, прежде чем использовать устройство в эксперименте с хемотаксисом. Поместите 10 микролитров цельной крови в 1,5-миллилитровую пробирку. Затем добавьте 2 микролитра коктейля антител в два микролитра магнитных частиц из набора для выделения нейтрофилов и аккуратно перемешайте пробирку, чтобы магнитно пометить клетки, помеченные антителами. Инкубируйте этикеточную смесь в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем прикрепите два небольших магнитных диска к двум сторонам порта загрузки ячеек устройства. Отсасывайте среду из всех портов устройства. Затем медленно внесите два микролитра меченой смеси крови в микрофлюидное устройство из порта загрузки клеток. Поместите микрофлюидное устройство на предметный столик микроскопа с регулируемой температурой при температуре 37 градусов Цельсия. Подождите несколько минут, пока достаточное количество нейтрофилов не будет захвачено в зоне стыковки клеток.
Затем добавьте 100 микролитров раствора хемоаттрактанта в 100 микролитров миграционной среды в предназначенные для этого входные резервуары с помощью двух пипеток. Это позволит создать градиент хемоаттрактанта путем непрерывного смешивания химических веществ на основе ламинарного потока. Хемоаттрактантом могут быть рекомбинантные белки, такие как FMLP, или клинические образцы, такие как надосадочная жидкость мокроты пациентов с ХОБЛ.
После стабилизации потока получите флуоресцентные изображения градиента декстрана FITC в канале. Затем инкубируйте устройство на предметном столике микроскопа с регулируемой температурой или в обычном инкубаторе для клеточных культур в течение 15 минут. После инкубации визуализируйте градиентный канал, используя объектив с 10-кратным увеличением, чтобы записать конечное положение клетки для анализа данных.