Анализ in vitro для изучения цитотоксичности предварительно активированных CD8⁺ Т-клеток в отношении раковых клеток

Возьмем две популяции CD8⁺ Т-клеток: эффекторные CD8⁺ Т-клетки, предварительно активированные через антителопосредованное взаимодействие Т-клеток и ко-стимулирующих рецепторов, и подавленные CD8⁺ Т-клетки, ингибируемые миелоидными супрессорными клетками.

Добавьте эти Т-клетки в лунки, покрытые базальной мембраной, с раковыми клетками, экспрессирующими флуоресцентный белок, ограниченный ядрорами.

Пипетка флуорогенного субстрата каспазы-3 — ДНК-связывающего флуорогенного красителя, конъюгированного с пептидом, содержащим сайт узнавания каспазы-3.

инкубировать. Эффекторные Т-клеточные рецепторы связываются с МНС-пептидным комплексом класса I на раковых клетках, вызывая высвобождение цитотоксических гранул, содержащих перфорины и гранзимы.

Перфорины создают поры мембраны раковых клеток, обеспечивая проникновение гранзима и активацию каспаз, инициируя апоптоз.

Активированные каспазы дополнительно расщепляют субстрат флуорогенных каспаз, высвобождая краситель, который связывается с ДНК и флуоресцирует.

Под флуоресцентным микроскопом раковые клетки, культивируемые совместно с эффекторными Т-клетками, демонстрируют двойную ядерную флуоресценцию, что указывает на апоптоз раковых клеток.

Напротив, раковые клетки, совместно культивируемые с подавленными Т-клетками, демонстрируют только флуоресценцию ядерных белков, что позволяет предположить наличие неапоптотических клеток.

Чтобы создать предварительно активированную CD8-положительную Т-клетку-мишень для совместной культуры клеток, сначала добавьте 30 микролитров 1-100 разбавленной растворимой матрицы базальной мембраны с пониженным фактором роста в соответствующие лунки 96-луночного планшета с плоским дном, пригодного для микроскопии. Встряхните планшет, чтобы равномерно распределить матрицу, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур не менее чем на один час. Пока пластина уравновешивается, подготовьте целевые ячейки. Отсадите среду, промойте PBS, и добавьте 1 миллилитр 0,05% трипсина-ЭДТА при комнатной температуре на 1 минуту.

Добавьте 9 миллилитров DMEM, дополненного фетальной бычьей сывороткой путем щадящего пипетирования, и перенесите диссоциированные клетки в пробирки. После центрифугирования ячеек повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах EDMEM. Отфильтруйте ресуспендированные клетки через клеточное ситечко и подсчитайте живые клетки. Затем отрегулируйте плотность до 4 умно-10 до четвертой мишени клеток на миллилитр в свежем EDMEM на льду.

Затем несколько раз пипетируйте предварительно активированные CD8-положительные Т-клетки, чтобы ресуспендировать клетки в одноклеточную суспензию, и перенесите плавающие Т-клетки в одну 1,5-миллилитровую пробирку для каждого условия. Соберите все оставшиеся клетки с помощью 200 микролитров PBS на лунку, перелейте смывки в соответствующие 1,5-миллилитровые пробирки и центрифугируйте. Отсадите среду, и добавьте 1 миллилитр EDMEM в каждую пробирку для центрифугирования.

После центрифугирования суспендируйте гранулы в 100 микролитрах свежего EDMEM на пробирку. После подсчета отрегулируйте клетки в каждой пробирке до плотности 1,6 умножить на 10 до пятой части предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток на миллилитр среды и поместите клетки на лед. Когда клетки будут готовы, отсасывайте матрицу базальной мембраны из каждой лунки 96-луночной микроскопической пластины и добавляйте 50 микролитров клеток-мишеней в отдельные лунки в пределах внутренних 60 лунок пластины при перемешивании.

Добавьте в соответствующие лунки 25 микролитров EDMEM с добавлением 4 умно-10 на треть единиц на миллилитр IL-2 и 10 микромолярных флуорогенных подложек каспаз-3. Затем добавьте 25 микролитров предварительно активированных CD8-положительных Т-клеток в соответствующие лунки и, наконец, добавьте EDMEM в соответствующие лунки, чтобы получить общий объем до 100 микролитров. Добавьте 200 микролитров PBS или стерильной воды во все пустые лунки, встряхните тарелку и оставьте тарелку на ровной поверхности на 10 минут.

Для получения изображений клеток микроскоп должен быть настроен на получение изображений в фазовом контрасте, а также флуоресцентных каналов, подходящих для флуоресцентного белка с ограничением ядра и флуорофоров субстрата каспазы-3, активированных флуорогенными веществами, использованными в эксперименте. Затем сделайте снимки каждой экспериментальной лунки в фазовом контрасте и двух флуоресцентных каналов каждые один-три часа в течение не менее 72 часов.