Анализ in vitro для изучения цитотоксичности предварительно активированных CD8⁺ Т-клеток в отношении раковых клеток

Возьмем две популяции CD8⁺ Т-клеток: эффекторные CD8⁺ Т-клетки, предварительно активированные через антителопосредованное взаимодействие Т-клеток и ко-стимулирующих рецепторов, и подавленные CD8⁺ Т-клетки, ингибируемые миелоидными супрессорными клетками.

Добавьте эти Т-клетки в лунки, покрытые базальной мембраной, с раковыми клетками, экспрессирующими флуоресцентный белок, ограниченный ядрорами.

Пипетка флуорогенного субстрата каспазы-3 — ДНК-связывающего флуорогенного красителя, конъюгированного с пептидом, содержащим сайт узнавания каспазы-3.

инкубировать. Эффекторные Т-клеточные рецепторы связываются с МНС-пептидным комплексом класса I на раковых клетках, вызывая высвобождение цитотоксических гранул, содержащих перфорины и гранзимы.

Перфорины создают поры мембраны раковых клеток, обеспечивая проникновение гранзима и активацию каспаз, инициируя апоптоз.

Активированные каспазы дополнительно расщепляют субстрат флуорогенных каспаз, высвобождая краситель, который связывается с ДНК и флуоресцирует.

Под флуоресцентным микроскопом раковые клетки, культивируемые совместно с эффекторными Т-клетками, демонстрируют двойную ядерную флуоресценцию, что указывает на апоптоз раковых клеток.

Нап