$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Добавьте образцы слезы человека и коктейль из антител и бусин в промытую аналитическую пластину.
Антитела связываются с магнитными шариками с цветовой кодировкой, пропитанными различными пропорциями флуорофоров, соответствующих различным спектральным сигнатурам, что облегчает обнаружение множественных цитокинов.
Цитокины слезы связываются с соответствующими антителами захвата, связанными с бусинами.
С помощью магнитной промывки пластин установите комплексы антитела-шарики. С помощью буфера удалите несвязанные биомолекулы.
Добавьте биотинилированные антитела к детектированию, которые прикрепляются к связанным цитокинам.
Пипетка стрептавидин-фикоэритриновый конъюгат, который связывается с биотинилированными антителами.
С помощью шайбы для тарелок удалите несвязанное содержимое лунки. Ресуспендируйте связанные с цитокинами комплексы в жидкости оболочки
.
Во время анализа образца жидкостная система транспортирует шариковые комплексы к оптическому узлу.
Первый лазер активирует внутренние шарики красителей, в результате чего полученный сигнал идентифицирует конкретные цитокины.
Второй лазер активирует репортерную молекулу, связанную с комплексом шариков, интенсивность сигнала которого представляет собой концентрацию цитокинов, что позволяет одновременно количественно определять несколько цитокинов.
Чтобы провести мультиплексный анализ на основе шариков, доведите все реагенты до комнатной температуры и сделайте их вихревыми в течение 5-10 секунд. Если образцы слезы с элюированием хранились при температуре минус 80 градусов Цельсия до проведения анализа, разморозьте замороженные экстракты слезы на льду и центрифугируйте образцы при 1000 г в течение пяти минут. Подготовьте лист анализа в вертикальной конфигурации для рабочих стандартов цитокинов человека QC-1, QC-2 и образцов.
Добавьте 200 микролитров 1x промывочного буфера в каждую лунку пластины и запечатайте ее герметиком для пластин. Затем выдержите тарелку в шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем сцедите буфер для стирки 1x, перевернув пластину, и несколько раз постучите им по впитывающим полотенцам, чтобы удалить остатки буфера для стирки в лунках.
Затем добавьте по 25 микролитров каждого рабочего стандартного цитокина человека QC-1, QC-2 и бланк только с буфером для анализа и образцами в соответствующие лунки. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров пробирного буфера. Затем в лунки добавьте 25 микролитров 1x раствора коктейля из бусин антител.
Поскольку раствор гранул антитела чувствителен к свету, закройте планшет и накройте его алюминиевой фольгой и крышкой для защиты от света во время анализа. Инкубируйте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в шейкере на ночь. На следующий день поместите пластину на решетку для тарелок автоматической магнитной мойки пластин и дайте ей постоять одну минуту, чтобы магнитные шарики осели на дне лунки.
Отсадите содержимое лунки и добавьте 200 микролитров промывочного буфера на лунку с помощью автоматической магнитной промывочной машины. Дайте тарелке постоять одну минуту, а затем втяните содержимое лунки, как и раньше, и повторите промывку еще раз. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раствора антител для обнаружения. Закройте тарелку, накройте ее алюминиевой фольгой и крышкой тарелки и выдержите при комнатной температуре в шейкере в течение 60 минут. Затем добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раствора стрептавидина-фикоэритрина, а после запечатывания и накрытия тарелки выдерживайте при комнатной температуре в шейкере в течение 30 минут.
После инкубации поместите пластину на магнитную шайбу для пластин и оставьте на одну минуту. Затем аспирируйте содержимое лунки и добавьте 200 микролитров промывочного буфера на лунку. Дайте ему постоять одну минуту, затем втяните содержимое лунки, прежде чем повторить промывку еще раз. Добавьте в каждую лунку по 150 микролитров жидкости оболочки. Затем поместите планшет на шейкер на пять минут при комнатной температуре, чтобы повторно суспендировать гранулы антител, прежде чем приступить к чтению планшета и анализу концентраций цитокинов.