Микронейтрализационный анализ для измерения титров нейтрализующих антител в сыворотке крови человека

Для проведения микронейтрализационного анализа берут многолуночный планшет, содержащий инактивированную при нагревании, серийно разбавленную сыворотку крови человека с уменьшающимися концентрациями специфических для гриппа нейтрализующих антител.

Внедрение патогенных вирусов гриппа. Сывороточные антитела взаимодействуют с вирусами и нейтрализуют их; Тем не менее, более высокие разведения сыворотки крови демонстрируют ограниченную нейтрализацию вируса.

Семена с клетками собачьих почек Madine-Darby, или MDCK, с избыточной экспрессией остатков сиаловой кислоты человека на их поверхности.

При более высоком разведении ненейтрализованные вирусы гриппа сливаются с сиаловой кислотой клеток, высвобождая вирусный геном в цитоплазму клетки.

Вирусные гены транскрибируются и транслируются в вирусные белки и нуклеопротеины внутри клетки-хозяина.

Обрабатывайте высокой концентрацией ацетона для фиксации и пермеабилизации.

Введение первичных антител, взаимодействующих с вирусными нуклеопротеинами.

Наложение на фермент-конъюгированные вторичные антитела, которые взаимодействуют с первичными антителами. Вымойте и обработайте ферментным субстратом, получив красящий продукт.

Количественно определите интенсивность цвета и нанесите ее на график в зависимости от разведения сыворотки; максимальное разведение сыворотки, достигающее пятидесятипроцентной нейтрализации вируса, представляет собой титр нейтрализации.

В 1-й день анализа MN разморозьте сыворотки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и удалите сразу после размораживания. Тепло инактивируйте сыворотку крови человека на 30 минут в водяной бане при температуре 56 градусов Цельсия, как описано в текстовом протоколе. Затем поместите сыворотку на лед и добавьте разбавитель вируса в сыворотку для предварительного разведения от 1 до 10.

Чтобы провести тест с одним вирусом, добавьте 50 микролитров разбавителя вируса в строки от B до H, за исключением столбцов 11 и 12. Затем добавьте 100 микролитров 1 из 10 разбавленных сывороток в колонки от А1 до А10. Выполните двукратное последовательное разведение от рядов A до H и отбросьте последние 50 микролитров в строке H.

Для борьбы с вирусами добавьте 50 микролитров разбавителя вируса в лунки A12, B12, C12 и D12. Для клеточного контроля добавьте 100 микролитров разбавителя вируса в лунки E12, F12, G12 и H12. Для контрольной сыворотки добавьте 100 микролитров разбавленной контрольной сыворотки в лунку А, столбец 11, и добавьте 50 микролитров разбавителя вируса в лунки от В11 до Н11. Приступайте к последовательному разбавлению. Накройте пластины крышками и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, до готовности к присоединению вируса.

Для присоединения вируса разбавьте вирус до 100 TCID50 в 50 микролитрах с разбавителем вируса. Добавьте по 50 микролитров разведенного вируса во все лунки, кроме столбца 11 на задних титровающих планшетах и контрольных лунок клеток E12, F12, G12 и H12 на всех планшетах. Добавьте по 50 микролитров разбавителя вируса во все лунки в столбце 11. Затем добавьте в первую лунку 50 микролитров вируса по 100 TCID50 на 50 микролитров.

Далее перемешиваем и переливаем 50 микролитров в последовательные лунки для выполнения двухкратных серийных разведений. Поменяйте наконечники пипеток между лунками, чтобы избежать переноса вируса. Выбросьте 50 микролитров из колодца H11, затем добавьте 50 микролитров разбавителя вируса в колонку 11, чтобы довести итоговый объем до 100 микролитров. Постукивайте по тарелкам для перемешивания. Инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа перед добавлением клеток MDCK в первый день и ИФА во второй день, как и раньше.

После добавления первичных и вторичных антител, как описано в текстовом протоколе, выполните добавление субстрата и чтение планшета. Вымойте пластины пять раз с 300 микролитрами буфера для стирки и постучите безворсовой салфеткой. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежеприготовленного субстрата OPD. Затем инкубируйте планшеты при комнатной температуре до тех пор, пока контрольные лунки вируса не достигнут оптической плотности на 490 нанометров в диапазоне от 0,8 до 3, при этом контрольная клетка при низком фоновом OD не составит менее 0,2. Далее во все лунки добавьте по 100 микролитров стоп-раствора.

Считывание ОП лунок на 490 нанометрах с помощью микропланшетного спектрофотометра. Наконец, определите титр нейтрализующих антител для каждого образца сыворотки, как описано в текстовом протоколе.