Анализ для выявления продукции активных форм кислорода в тканях риса при иммунном выявлении

Возьмите микропланшет, содержащий однородные сегменты оболочки, вырезанные из проростков риса, и листовые диски, полученные из листьев растения риса.

Добавьте стерильную воду и инкубируйте в течение ночи, чтобы обеспечить восстановление после напряжения раны.

Добавьте иммуногенный пептид, полученный из бактериальных жгутиков, который действует как патоген-ассоциированный молекулярный паттерн или PAMP.

Растительные клетки на краях разреза связываются с PAMP через рецепторы распознавания образов.

Связывание запускает нисходящую передачу сигналов, активируя локализованный в плазматической мембране фермент, называемый гомологом респираторной оксидазы или RBOH.

Активированный RBOH производит активные формы кислорода или АФК в апопласте — межклеточном пространстве. Полученная АФК преобразуется в перекись водорода.

Добавьте фермент пероксидазу и хемилюминесцентный субстрат.

Пероксидаза использует перекись водорода для преобразования субстрата в промежуточный продукт в возбужденном состоянии, который высвобождает энергию в виде света и возвращается в основное состояние.

Измерьте люминесценцию в обоих типах тканей, чтобы обнаружить резкое увеличение сразу после лечения PAMP, указывающее на взрыв АФК.

Острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием для предварительной обработки за сутки до анализа АФК разрежьте оболочку из 10-дневных проростков риса на 3-миллиметровые сегменты. Поместите 5 сегментов оболочки в индивидуальную лунку 96-луночного микротитровального планшета, содержащего 100 микролитров дважды дистиллированной воды, на 10-12 часов.

Разрежьте листовые диски у четырех-шестинедельных растений риса с помощью биопсийного перфоратора с помощью поршня. Всегда обрезайте листовые диски от средней трети второго листа основного культиватора, чтобы уменьшить вариацию данных. Затем поместите один листовой диск в индивидуальную лунку 96-луночного микротитровального планшета, содержащего 100 микролитров дважды дистиллированной воды, на 10-12 часов для предварительной обработки. Держите все листовые диски плавающими и обращенными вверх в лунках микротитровальной пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать изменений, связанных со стороны листа.

Приготовьте эликвитирующий раствор, смешав 9,4 мл 50 микромоляров трис-HCl, 400 микролитров раствора L-012, 100 микролитров пероксидазы хрена и 100 микролитров flg22. Добавьте в лунки 200 микролитров раствора для выявления.

Запустите программное обеспечение и нажмите кнопку «Эксперименты», чтобы создать новый протокол или использовать существующий. Нажмите кнопку Процедура во всплывающем окне, чтобы настроить пластину и выбрать скважины из пластины, которые будут контролироваться. Нажмите кнопку Start Kinetic и установите время выполнения на 30 минут или дольше, в зависимости от требований эксперимента. Выберите минимальный интервал, чтобы получать показания как можно чаще, а для времени интеграции выберите 1 секунду или больше, в зависимости от интенсивности сигнала.

Нажмите «Подтвердить», а затем «ОК», чтобы подтвердить настройки. Затем нажмите «Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программное обеспечение не запустит диалоговое окно загрузки пластины. Осторожно удалите двойную дистиллированную воду из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения или высыхания тканей. С помощью многоканальной пипетки добавьте 200 микролитров эликтационного раствора в лунки, содержащие ткани. Поместите проверяемую пластину на носитель и начните обнаружение.