Измерение аллореактивности в смешанной популяции Т-клеток

Начните с многолуночного планшета, содержащего дендритные клетки мыши, или ДК, несущие аллоантигены или генетические варианты собственных антигенов.

Вводите мышиные Т-клетки, в том числе аллореактивные Т-клетки, которые не реагируют на собственные антигены, распознавая при этом чужеродные антигены.

Аллореактивные Т-клетки распознают эти аллоантигены и взаимодействуют с ДК, вызывая перестройку цитоскелета, включая реорганизацию F-актина.

Это способствует тому, что рецепторы на Т-клетках взаимодействуют с костимулирующими молекулами на ДК, формируя клеточную связь — иммунологический синапс.

Зафиксируйте клетки, перенесите их в пробирку и введите коктейль меченых флуорохромом антител, специфичных для Т-клеточных и DC-рецепторов, придающих отчетливую флуоресценцию.

Удалите несвязанные антитела и ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем проникающий агент, который проникает в клетки, и маркеры белка, помеченные зелеными флуорофорами, которые связываются с F-актином.

Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем ядерный краситель, окрашивая ядра в красный цвет.

Используя проточную цитометрию с визуализацией, определите дублеты, соответствующие Т-клеточным и DC-конъюгатам, с зеленым перекрестием F-актина, подтверждающие образование синапсов.

Количественно определите дублеты, представляющие степень аллореактивности.

Начните с посева 0,5 умно-10-шестых дендритных клеток в каждую лунку 96-луночного клеточного планшета, а затем 1 умножить 10-шестую Т-клетки в окончательном объеме до 50 микролитров питательной среды в каждой лунке. Инкубируйте холодные культуры в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Затем добавьте в каждую лунку в три раза больше объема культуры 1,5% формальдегида в PBS на 30 минут при комнатной температуре. По окончании фиксации клетки из каждой лунки переложить в соответствующую 5-миллилитровую полистирольную трубку, а в клетки закрасить соответствующими фторохром-конъюгированными антителами в 100 микролитрах промывочного буфера на 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.

Далее промойте клетки в 1 миллилитре промывочного буфера и повторно суспендируйте гранулы в буфере для химической завивки, содержащем фаллоидин-ФИТК. Еще через 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте промойте клетки по 1 миллилитру свежей химической завивки буфера. Повторно суспендируйте гранулы в ядерном красителе, представляющем интерес в буфере для промывки для химической завивки, для заключительной 30-минутной инкубации при комнатной температуре, защищенной от света, и промойте клетки в 1 миллилитре буфера для промывки для химической завивки, а затем промывку только в буфере для промывки. Затем повторно суспендируйте клетки в 50-100 микролитрах свежего буфера для промывки и переложите клетки в микроцентрифужные пробирки с маленькими крышками.

Чтобы проанализировать межклеточные взаимодействия, сначала зарезервировайте один канал для получения изображений в светлом поле и загрузите первую контрольную трубку. Если канал светлого поля выключен, в окне «Рабочая область» создайте новую диаграмму рассеяния для каждого используемого канала с соотношением сторон по площади и закрутите синглеты, где соотношение сторон близко к единице.

Для каждого флуорохрома проверьте положительное количество и при необходимости отрегулируйте напряжение лазера в коробке подсветки. В поле Каналы выберите соответствующие каналы для флуорохромов, используемых при окрашивании. Затем нажмите кнопку Запись. Когда количество событий достигнет заданного порога, сбор данных будет автоматически остановлен.

После того, как все контрольные показатели одиночного окрашивания будут получены, загрузите первую пробирку для экспериментального образца и получите несколько десятков тысяч событий по соответствующим каналам анализа, включая канал светлого поля.