Измерение аллореактивности в смешанной популяции Т-клеток

Начните с многолуночного планшета, содержащего дендритные клетки мыши, или ДК, несущие аллоантигены или генетические варианты собственных антигенов.

Вводите мышиные Т-клетки, в том числе аллореактивные Т-клетки, которые не реагируют на собственные антигены, распознавая при этом чужеродные антигены.

Аллореактивные Т-клетки распознают эти аллоантигены и взаимодействуют с ДК, вызывая перестройку цитоскелета, включая реорганизацию F-актина.

Это способствует тому, что рецепторы на Т-клетках взаимодействуют с костимулирующими молекулами на ДК, формируя клеточную связь — иммунологический синапс.

Зафиксируйте клетки, перенесите их в пробирку и введите коктейль меченых флуорохромом антител, специфичных для Т-клеточных и DC-рецепторов, придающих отчетливую флуоресценцию.

Удалите несвязанные антитела и ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем проникающий агент, который проникает в клетки, и маркеры белка, помеченные зелеными флуорофорами, которые связываются с F-актином.

Центрифугируйте и ресуспендируйте клетки в буфере, содержащем ядерный краситель, окрашивая ядра в красный цвет.

Используя проточную цитометрию с визуализацией, определите дублеты, соответствующие Т-клеточным и DC-конъюгата