Идентификация и подсчет иммунных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа методом проточной цитометрии

Начните с многолуночного планшета, содержащего жидкость бронхоальвеолярного лаважа мыши, содержащую популяцию иммунных клеток, окрашенную зеленым флуоресцентным красителем для повышения жизнеспособности.

Вводите Fc-антитела для блокирования Fc-рецепторов иммунных клеток.

Добавьте коктейль из различных меченых флуорофорами антител, нацеленных на определенные клеточные маркеры. Удалите несвязанные антитела и снова суспендируйте клетки в буфере.

С помощью проточной цитометрии выявить тусклые флуоресцентные синглеты, указывающие на живые клетки.

Освещайте клетки на частоте 488 нанометров, заставляя клетки излучать красную флуоресценцию, коррелирующую с клетками, экспрессирующими CD11c.

В популяции с высоким уровнем CD11c с помощью соответствующих фильтров длины волны идентифицировать белки-маркеры MHC-II на дендритных клетках и SiglecF на макрофагах.

В популяции с низким уровнем CD11c экспрессия CD3 на Т-клетках и CD19 на В-клетках позволяет их идентифицировать.

Освещайте клетки на частоте 405 нанометров, излучая синюю флуоресценцию, обозначающую нейтрофилы, экспрессирующие CD11b.

Освещение клеток на глубине 633 нанометра возбуждает дальние красные флуорофоры на эозинофилах, экспрессирующих Ly-6G.

Используя данные проточной цитометрии, перечислите обилие каждого типа иммунных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

После сбора третьего бронхоальвеолярного лаважа центрифугируйте объединенный аспират и храните надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов Цельсия. Ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах буфера для лизиса ACK. Не более чем через две минуты при комнатной температуре разбавьте буфер для лизиса одним миллилитром холодного PBS и соберите клетки методом центрифугирования.

Ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме PBS для количества анализируемых образцов и заведите ячейки в соответствующее количество лунок 96-луночной пластины для проведения анализа. Соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования и повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах блока FC в PBS.

Через 10 минут при комнатной температуре добавьте в каждую лунку по 50 микролитров соответствующего коктейля антител и инкубируйте клетки в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. В конце инкубации центрифугируют планшет и отбраковывают надосадочную жидкость, суспендируя гранулы до конечного объема 200 микролитров буфера FACS на лунку для проточного цитометрического анализа.