JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 6:08 мин • July 8th, 2025
Возьмите многолуночный планшет, содержащий микобактерии. Добавьте в лунки увеличивающиеся концентрации тестовых соединений.
инкубировать. В зависимости от действия соединения на микобактерии, оно может либо подавлять рост микобактерий, проявляя бактериостатическую активность, либо уничтожать микобактерии, проявляя бактерицидную активность.
Хорошо перенесите аликвоты на древесный уголь агар резазуриновый анализ, или CARA, микропланшет, содержащий агар с активированным углем, чтобы абсорбировать исследуемое соединение, предотвращая эффекты переноса.
инкубировать. Бактериостатическая активность соединения подавляет репликацию микобактерий, в то время как бактерицидная активность снижает жизнеспособность микобактерий.
Добавьте буфер, резазурин и неионогенное поверхностно-активное вещество, чтобы диспергировать резазурин в лунках.
В метаболически активных микобактериях дегидрогеназы восстанавливают слабофлуоресцентный резазурин синего цвета до розового флуоресцентного резоруфина.
С помощью считывателя микропланшетов измерьте флуоресценцию резоруфина в лунках.
Лунки, в которых отсутствует флуоресценция резоруфина, указывают на бактерицидную активность соединения.
Варьирующаяся интенсивность флуоресценции в разных лунках указывает на живую бактериальную нагрузку, отражая зависящую от концентрации бактерицидную или бактериостатическую активность исследуемых соединений.
Инокулировать полипропиленовые центрифужные пробирки с круглым дном или конические центрифуги, содержащие соответственно 4 или 20 миллилитров Middlebrook 7H9-ADN или 7H9-OADC, с наружным диаметром580 от 0,01 до 0,1. Инкубируйте культуры M. smegmatis при температуре 37 градусов Цельсия и 20%O2 с встряхиванием, расширяя культуры до средней логарифмической фазы или приблизительного наружного диаметра580 0,5.
Чтобы провести эксперимент с минимальной ингибиторной концентрацией в условиях репликации и нерепликации, распределите 200 микролитров клеток в 7H9-ADN с наружным диаметром580 0,01 во все лунки 96-луночного планшета, обработанного культурой тканей с прозрачным дном.
Для нереплицирующегося анализа используйте PBS, содержащий 0,02% тилоксапола, для двукратной промывки клеток и используйте нереплицирующуюся среду для ресуспендирования клеток. Используйте нереплицирующуюся среду для разбавления клеток до наружного диаметра580 0,1 и добавьте нитрит натрия до конечной концентрации от 0,5 до 5 миллимоль из свежеприготовленного 1 молярного запаса.
Распределите 200 микролитров клеток с наружным диаметром580 0,1 во все лунки 96-луночного планшета, обработанного культурой тканей с прозрачным дном. После подготовки тестовых агентов в соответствии с текстовым протоколом добавьте 2 микролитра тест-агента #1 в ряды от A до E и 2 микролитра тест-агента #2 в ряды от E до H и тщательно перемешайте.
Для повторных анализов инкубируйте микропланшеты M. smegmatis при 37 градусах Цельсия, 20%О2 и 5% СО2 в течение 1–48 часов. В моменты времени, в которых CARA будет использоваться в качестве считывателя, используйте многоканальный дозатор P200 объемом от 50 до 75 микролитров для тщательной ресуспендирования содержимого лунки контрольной пластины типа MIC90 путем пипетирования вверх и вниз от 5 до 10 раз. Затем с помощью наконечников пипеток аккуратно вращайте содержимое лунок круговыми движениями.
Перенесите 10 микролитров неразбавленного содержимого пробирной лунки в соответствующие лунки микропланшета CARA, избегая разбрызгивания во время переноса и следя за тем, чтобы аликвота объемом 10 микролитров попала в середину лунок микропланшета CARA. С помощью пластинчатой ленты свяжите стопки микропланшетов CARA, а затем поместите их в закрывающийся пластиковый пакет. Инкубируйте микропланшеты M. smegmatis CARA при температуре 37 градусов Цельсия с 20% О2 в течение одного-двух дней для реплицирующихся планшетов и в течение двух-трех дней для нереплицирующихся планшетов.
Когда в отрицательных контрольных лунках видна пленка бактериального роста или более крупные макроскопические колонии, используйте один набор из 12 наконечников P200 с многоканальной пипеткой для дозирования 40 микролитров стерильного PBS вдоль боковых стенок лунок и позвольте PBS распределиться по верхушке бактериальных микроколоний агара.
Приготовьте проявляющий реагент CARA, смешав 5 миллиграммов резазурина и 50 миллилитров 5% Tween-80 в PBS. Добавьте 50 микролитров свежеприготовленного проявляющего реагента CARA в каждую лунку микропланшета CARA. Затем покачайте пластины вперед и назад несколько раз, чтобы помочь распределить реагент по агару и бактериальному мату в каждой лунке. Поместите планшеты в закрывающийся пластиковый пакет и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия не менее 30 минут для M. smegmatis.
Перед считыванием показаний флуоресценции поместите микропланшеты CARA в биозащитный колпак на 15 минут при комнатной температуре со снятыми крышками. При использовании спектрофотометров BSL3 вне шкафа биобезопасности наклейте на пластину наклейку оптического качества ПЦР и плотно запечатайте ее мягким бумажным полотенцем, слегка надавливая на поверхность наклейки. Определение флуоресценции с помощью верхнего считывания с возбуждением на 530 нанометрах и излучением на 590 нанометрах.