Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 5:54 мин. • July 8th, 2025
Возьмите многолуночный планшет, содержащий мышиные фибробласты в среде, лишенной сыворотки. Добавьте серийные разведения TNFα-специфических антител.
Добавьте TNFα — воспалительный цитокин.
инкубировать. Сывороточная депривация вызывает клеточный стресс, делая клетки восприимчивыми к TNFα-опосредованному апоптозу.
Связывание TNFα со своими рецепторами на клетках, лишенных сыворотки, запускает внутриклеточные сигнальные каскады, активируя каскад каспаз и индуцируя апоптоз.
Однако связывание антител с TNFα препятствует связыванию его рецептора, ингибируя активацию каспаз.
После инкубации добавьте смесь реагентов, содержащую моющее средство, пролюминесцентный субстрат каспазы и фермент люциферазу, а также ионы АТФ и магния. Перемешайте и инкубируйте.
Детергент проникает в мембраны, высвобождая каспазы из TNFα-индуцированных клеток.
Биолюминесцентный субстрат содержит сайт распознавания каспаз. Специфические каспазы расщепляют субстрат, образуя аминолюциферин.
Люцифераза окисляет его субстрат, аминолюциферин, что приводит к выделению света.
Измерьте интенсивность люминесценции для обнаружения снижения люминесценции с увеличением концентрации антител, что указывает на активность специфич
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео