JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 5:54 мин • July 8th, 2025
Возьмите многолуночный планшет, содержащий мышиные фибробласты в среде, лишенной сыворотки. Добавьте серийные разведения TNFα-специфических антител.
Добавьте TNFα — воспалительный цитокин.
инкубировать. Сывороточная депривация вызывает клеточный стресс, делая клетки восприимчивыми к TNFα-опосредованному апоптозу.
Связывание TNFα со своими рецепторами на клетках, лишенных сыворотки, запускает внутриклеточные сигнальные каскады, активируя каскад каспаз и индуцируя апоптоз.
Однако связывание антител с TNFα препятствует связыванию его рецептора, ингибируя активацию каспаз.
После инкубации добавьте смесь реагентов, содержащую моющее средство, пролюминесцентный субстрат каспазы и фермент люциферазу, а также ионы АТФ и магния. Перемешайте и инкубируйте.
Детергент проникает в мембраны, высвобождая каспазы из TNFα-индуцированных клеток.
Биолюминесцентный субстрат содержит сайт распознавания каспаз. Специфические каспазы расщепляют субстрат, образуя аминолюциферин.
Люцифераза окисляет его субстрат, аминолюциферин, что приводит к выделению света.
Измерьте интенсивность люминесценции для обнаружения снижения люминесценции с увеличением концентрации антител, что указывает на активность специфических антител TNFα для нейтрализации TNFα и предотвращения TNFα-индуцированного апоптоза.
Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии во внутренние 60 лунок пробирной пластины, начиная со 2-й колонки по 11-ю. Смешайте клеточную суспензию с помощью пипетирования, чтобы добавить аликвоты в микропланшет. Немедленно перенесите 50 микролитров нанесенных разведений на пластину для анализа.
Для параллельных дорожек дозируйте разведения, поворачивая микропипетку. Картированные разведения могут быть дозированы в лунки в следующем порядке. Контрольные элементы распределяются в окружающих колодцах.
Разведите TNF-альфа с 500 микролитрами сверхчистой воды. Перемешайте с помощью вихревого смесителя со скоростью 2 200 об/мин. Переложите в пробирку объемом 15 мл и, наконец, разбавьте до 40 нанограмм на мл с помощью питательной среды. Нанесите 50 микролитров раствора для индукции апоптоза в 60 внутренних наружных лунок. Дозируйте микролитры раствора для индукции апоптоза в 60 внутренних пробирных лунок. Наконец, выдерживайте в течение 16 часов.
На пятый день восстановите субстрат буферным раствором в соответствии с инструкциями производителя. Перемешайте, перевернув пять раз. Диспенсируйте раствор субстрата и добавьте 50 микролитров раствора субстрата в каждую лунку для образца в пластине для анализа. Также добавьте подложку к элементам управления. Взбалтывайте пробу в вихревом смесителе со скоростью 400 об/мин в течение трех минут.
Достаньте пробирную пластину из смесителя и инкубируйте при комнатной температуре. Включите пластину-считыватель спектрофотометра. Откройте программное обеспечение Softmax Pro или любую аналогичную программу. Загрузите микропланшет в спектрофотометр и отрегулируйте следующие параметры.
Активируйте функцию люминесценции на риге типа в функцию конечной точки. Отрегулируйте область оснастки без учета столбцов 1 и 12. Выберите тип планшета для стандартного 96-луночного микропланшета с прозрачным дном. Изменяйте время интеграции до 1250 миллисекунд. Отрегулируйте время встряхивания микропланшета на 10 секунд. Выберите стену, в которой будет размещено эталонное вещество, аналитическое вещество и контрольный образец. Начните читать.