Импульсный анализ in vitro на основе дендритных клеток вакцины для индуцирования пролиферации лимфоцитов

Начните с добавления антигенов тестируемой вакцины в культуру дендритных клеток.

Дендритная клетка распознает антиген, интернализует его через рецептор-опосредованный эндоцитоз, фрагментирует его на более мелкие пептиды и переносит полученный комплекс антиген-MHC на поверхность клетки для презентации.

Совместное культивирование антигенпрезентирующих дендритных клеток с наивными Т-лимфоцитами для обеспечения взаимодействия между рецептором Т-клеток и комплексом антиген-MHC, а также их корецепторами.

Это приводит к образованию иммунологических синапсов, активирующих Т-лимфоциты через внутриклеточную сигнализацию.

Активированные Т-лимфоциты подвергаются клональной экспансии, образуя эффекторные Т-лимфоциты.

Добавьте в культуру молекулы цитокинов интерлейкина-2, или ИЛ-2, и инкубируйте. Связывание IL-2 запускает внутриклеточную сигнализацию, обеспечивая пролиферацию и выживание лимфоцитов.

Возьмите небольшой объем культуры и центрифугируйте. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу антигенпрезентирующими дендритными клетками и перенесите ее в ту же лунку.

Рестимуляция антигеном увеличивает пролиферацию лимфоцитов.

Выполните последующий анализ для количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов.

Чтобы получить антиген-импульсные MoDC, добавьте 1 микролитр на миллилитр вакцины против вируса бешенства или суспензии RV к 1 миллилитру наивной культуры MoDC в 24-луночном планшете и инкубируйте планшет в течение 48 часов при 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия. На седьмой день подержите 24-луночный планшет, содержащий антиген-импульсные MoDC, на льду в течение 10 минут, прежде чем добавить 1 миллилитр ледяного PBS на лунку и тщательно перемешать его. Переложите суспензию в 15-миллилитровую трубку.

Промойте лунки 2 миллилитрами ледяного PBS. Соберите остаточные клетки в каждой лунке и переложите промытое содержимое в соответствующие пробирки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 г в течение 7 минут. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте антиген-импульсную клеточную гранулу MoDCs в полной культуральной среде, чтобы отрегулировать конечную концентрацию 100 000 клеток на миллилитр.

Для совместного культивирования лимфоцитов MoDC засейте лунки стерильного 24-луночного планшета 1 миллилитром суспензии наивных лимфоцитарных клеток и 1 миллилитром антиген-импульсной или неантиген-импульсной суспензии MoDC на седьмой день антигенного импульса. После двух дней инкубации дополните каждую лунку 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного интерлейкина-2 и продолжайте инкубацию еще 120 часов.

На 14 день переложите 1 миллилитр сокультуры в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку, и центрифугируйте пробирку. Затем ресуспендируйте клеточную гранулу с 1 миллилитром антиген-импульсных или неимпульсных MoDC. Хорошо перемешайте и переложите клеточные суспензии в соответствующие лунки.

После окрашивания клеточной поверхности PBMCs и наивных лимфоцитов и моноцитов перенесите 1 миллилитр клеточной суспензии в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку с помощью пипетки и центрифугируйте в течение 10 минут при 500 г. Затем повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре PBS и переложите ее в 15-миллилитровую пробирку. Также соберите остаточные клетки и соответствующие пробирки с помощью 1 миллилитра PBS. Затем добавьте 10 миллилитров PBS в 15-миллилитровую трубку, содержащую клетки, и перемешайте с помощью пипетирования.

После центрифугирования пробирки в течение 7 минут при 850 г удалить надосадочную жидкость и осторожно повторно суспендировать клеточную гранулу с остаточной суспензией, оставшейся после сцеживания надосадочной жидкости. Перенесите суспензию элемента на 96-луночную пластину с V-образным днищем и загерметизируйте лунки, чтобы избежать утечки.

После завершения окрашивания проведите анализ с помощью проточного цитометра. В режиме предварительного просмотра в режиме реального времени отрегулируйте порог флуоресценции, включая напряжение, коэффициент усиления, а также размер ячейки, чтобы в конечном итоге нарисовать ворота вокруг желаемой популяции клеток, исключив при этом любой клеточный мусор.