Методика окрашивания пептидом-MHC-I тетрамером для анализа SIV-специфичных CD8⁺ Т-клеток памяти

Возьмем, к примеру, мононуклеарные клетки периферической крови приматов, или PBMC, содержащие CD8⁺ Т-клетки памяти против вируса иммунодефицита обезьян или SIV.

Добавьте ингибитор протеинкиназы для предотвращения интернализации рецептора Т-клеток, или TCR, при последующей стимуляции.

Ввести пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I, или тетрамеры pMHC-I, флуорофор-конъюгированные комплексы, содержащие четыре молекулы MHC-I, связанные с SIV-специфичными пептидами. Эти пептиды связываются с TCR на поверхности Т-клеток.

Добавьте смесь, содержащую флуорофор-конъюгированные антитела, связывающиеся с CD8, CD28 и CCR7 — маркерами, разграничивающими субпопуляции Т-клеток памяти, — и антитела, маркирующие не-CD8⁺ клетки.

Флуоресцентный краситель для определения жизнеспособности помечает мертвые клетки.

Закрепите клетки. Проникайте в них для доступа к внутриклеточным мишеням.

Добавьте флуорофор-конъюгированные антитела, связывающие CD3, маркер Т-клеток, и внутриклеточный гранзим B, активированный маркер CD8⁺ Т-клеток.

С помощью проточной цитометрии исключить не-CD8⁺ Т-клетки и мертвые клетки.

Gate pMHC-I тетрамер-позитивные CD8⁺ Т-клетки для характеристики различных субпопуляций CD