Методика окрашивания пептидом-MHC-I тетрамером для анализа SIV-специфичных CD8+ Т-клеток памяти
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 4:25 мин • July 8th, 2025
Возьмем, к примеру, мононуклеарные клетки периферической крови приматов, или PBMC, содержащие CD8+ Т-клетки памяти против вируса иммунодефицита обезьян или SIV.
Добавьте ингибитор протеинкиназы для предотвращения интернализации рецептора Т-клеток, или TCR, при последующей стимуляции.
Ввести пептид-главный комплекс гистосовместимости класса I, или тетрамеры pMHC-I, флуорофор-конъюгированные комплексы, содержащие четыре молекулы MHC-I, связанные с SIV-специфичными пептидами. Эти пептиды связываются с TCR на поверхности Т-клеток.
Добавьте смесь, содержащую флуорофор-конъюгированные антитела, связывающиеся с CD8, CD28 и CCR7 — маркерами, разграничивающими субпопуляции Т-клеток памяти, — и антитела, маркирующие не-CD8+ клетки.
Флуоресцентный краситель для определения жизнеспособности помечает мертвые клетки.
Закрепите клетки. Проникайте в них для доступа к внутриклеточным мишеням.
Добавьте флуорофор-конъюгированные антитела, связывающие CD3, маркер Т-клеток, и внутриклеточный гранзим B, активированный маркер CD8+ Т-клеток.
С помощью проточной цитометрии исключить не-CD8+ Т-клетки и мертвые клетки.
Gate pMHC-I тетрамер-позитивные CD8+ Т-клетки для характеристики различных субпопуляций CD8+ Т-клеток памяти на основе уровней гранзима B, CD28 и CCR7.
Начните с ресуспендирования резус-ПБК в среде R-10 в соотношении 1,6 умножить на 10 до 7 клеток на миллилитр. Аквотируйте 50 микролитров клеток на соответствующее количество пробирок проточной цитометрии, и добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров ингибитора протеинкиназы. Сделайте вихревую обработку каждой пробирки и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Нужное количество титруемого пептида тетрамера MHC должно быть разбавлено достаточно мастер-смесью, чтобы окрасить все экспериментальные пробирки. Поэтому важно подготовить избыток мастер-смеси на 15% для учета ошибок пипетирования.
Во время инкубации клеток гранулируйте белковые агрегаты и раствор тетрамера центрифугированием, чтобы свести к минимуму фоновое окрашивание. Затем разведите тетрамеры в достаточном буфере для окрашивания, чтобы в каждую пробирку проточной цитометрии можно было добавить 25 микролитров мастер-смеси тетрамера. Затем сделайте вихревые пробирки для образцов и инкубируйте растворы тетрамера PBMC в темноте при комнатной температуре в течение 45 минут. По окончании инкубации добавьте 50 микролитров окрашивающего мастермикса в соответствующие пробирки для образцов и перемешайте пробирки методом вортексинга.
Через 25 минут в темноте при комнатной температуре промойте клетки промывочным буфером, гранулируйте клетки центрифугированием и осторожно сцедите надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Переведите клетки в оставшийся буфер в каждой пробирке и зафиксируйте образцы 250 микролитрами 2% параформальдегида на пробирку. Сразу же сделайте вихрь и инкубируйте трубки в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. Через 20 минут промойте клетки в свежем буфере для промывки, гранулируйте клетки центрифугированием и сцедите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.
Ресуспендируют клетки в 500 микролитрах пермеабилизационного буфера, вихря и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Затем промойте и очистите клетки от гранул. Затем сцедите надосадочную жидкость, как описано ранее. Приступайте к добавлению 50 микролитров внутриклеточной красительной мастер-смеси в соответствующие пробирки. Ввергните каждый образец в вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. После того, как инкубация будет завершена, промойте и гранулируйте клетки. Теперь образцы готовы к получению с помощью проточного цитометра.
Обзор
В данной статье описывается метод характеристики субпопуляций CD8 + Т-клеток памяти у приматов с использованием проточной цитометрии. Протокол включает использование тетрамеров pMHC-I и различных антител для идентификации и анализа популяций Т-клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Введение
- T-клетки CD8+ играют решающую роль в иммунном ответе против вирусных инфекций.
- Понимание подмножеств Т-клеток памяти может дать ценные сведения для разработки вакцин и иммунотерапии.
- Проточная цитометрия является мощным инструментом анализа клеточных популяций на основе поверхностных и внутриклеточных маркеров.
- Тетрамеры pMHC-I необходимы для идентификации антигенспецифических T-клеток.
Цель исследования
- Разработать протокол выделения и характеристики CD8 + Т-клеток памяти из PBMC нечеловекообразных приматов.
- Оценить статус активации Т-клеток с использованием гранзима B и других маркеров.
- Углубить понимание Т-клеточных ответов на вирус иммунодефицита обезьян (SIV).
Используемые методы
- Выделение PBMC из крови приматов.
- Использование ингибиторов протеинкиназ для предотвращения интернализации TCR.
- Окрашивание тетрамерами pMHC-I и антителами, конъюгированными с флуорофорами.
- Проточный цитометрический анализ для характеристики субпопуляций T-клеток.
Основные результаты
- Успешная идентификация субпопуляций CD8 + Т-клеток памяти на основе уровней гранзима B, CD28 и CCR7.
- Продемонстрирована эффективность тетрамеров pMHC-I при выделении SIV-специфических Т-клеток.
- Представлен подробный протокол для будущих исследований Т-клеточных ответов.
- Подчеркнута важность надлежащего контроля и методов окрашивания при проведении проточной цитометрии.
Выводы
- Разработанный протокол является ценным инструментом для изучения Т-клеточного иммунитета у нечеловекообразных приматов.
- Данные, полученные в ходе этого исследования, могут быть использованы для разработки стратегий вакцинации против SIV и родственных вирусов.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения функционального значения выявленных субпопуляций Т-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точная идентификация и характеристика антигенспецифических CD8+ Т-клеток памяти имеет решающее значение для снижения рисков при выборе иммунологических мишеней, а также для обоснования стратегий разработки вакцин и иммунотерапии в доклинических моделях. Метод окрашивания тетрамерами пептид-MHC-I позволяет с высокой степенью достоверности проводить количественный анализ и фенотипирование субпопуляций Т-клеток, специфичных к SIV, что обеспечивает возможность прогностического иммунного мониторинга и трансляционную преемственность. Данная возможность расширяет возможности раннего поиска и валидации мишеней для портфелей препаратов в области инфекционных заболеваний и иммуноонкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать антигенспецифические Т-клеточные ответы на моделях приматов.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем дифференциации состояний памяти и активации с помощью поверхностных и внутриклеточных маркеров.
- Способствует снижению механистических рисков за счет количественного определения субпопуляций CD8+ Т-клеток, специфичных к SIV.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе и приоритизации иммунологических мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные методы проточной цитометрии для воспроизводимого обнаружения антигенспецифических Т-клеток.
- Стандартизирует стратегии гейтирования и панели маркеров для анализа подмножеств Т-клеток памяти.
- Обеспечивает количественное мультиплексное считывание данных для последующего скрининга соединений или вакцин.
- Предоставляет масштабируемые протоколы, адаптируемые к другим системам антигенов и моделям заболеваний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует конечные точки иммунологического мониторинга между моделями на приматах и трансляционными исследованиями на людях.
- Обеспечивает оценку эффективности вакцин или терапевтических средств в доклинических условиях на основе биомаркеров.
- Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе количественных иммунологических коррелятов.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации для препаратов, нацеленных на иммунную систему.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод проточной цитометрии с использованием тетрамеров интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, связывая раннюю валидацию иммунных мишеней с разработкой трансляционных биомаркеров.
- Фундаментальная биология: предоставляет надежные инструменты для проверки гипотез и выяснения механизмов Т-клеточного иммунитета.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для профилирования иммунных клеток и проверки готовности анализа.
- Аналитика: позволяет проводить статистическое сравнение частоты подмножеств Т-клеток памяти и маркеров активации в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию стратегий иммунного мониторинга между животными моделями и клиническими исследованиями.
- Корпоративное использование: предлагает многократно используемую платформу для анализа антигенспецифических Т-клеток в рамках различных исследовательских программ.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации иммунных мишеней и снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости анализов в рабочих процессах иммунного мониторинга.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет раннего снижения иммунологических рисков.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию и продвижение иммунологических активов с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области проточной цитометрии и иммунофенотипирования.
- Необходим доступ к многопараметрическим проточным цитометрам и валидированным панелям антител.
- Требуется строгая межлабораторная стандартизация протоколов гейтирования и окрашивания.
- Метод применим к различным антигенным системам, но зависит от наличия специфических тетрамеров pMHC.
- Потенциальные ограничения включают фоновое окрашивание и необходимость тщательного подбора контролей.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях
Похожие видео
0 Просмотры
Одновременная количественная оценка анти вектор и анти трансген конкретных CD8+ T клетки через MHC Тетрамер пятная после вакцинации с вирусный вектор
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция мыши Почки-Резидент CD8 -Т-клетки для анализа цитометрии потока
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров
Похожие видео
0 Просмотры
Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте
Похожие видео
0 Просмотры
Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8 + Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание
Похожие видео
0 Просмотры
Одноклеточных Quantitation мРНК и поверхности белков в инфицированных Обезьяний вирус иммунодефицита CD4+ T клетки изолированы от макак резус
Похожие видео
0 Просмотры
Количественная оценка пролиферации антигена человека конкретных CD4и Т-клеток с использованием Carboxyfluorescein Succinimidyl Эфир
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 22 августа 2026