Анализ на основе ламинарного потока для изучения взаимодействий между лейкоцитами и эндотелиальными клетками
JoVE Encyclopedia of Experiments
Иммунология
0 просмотров • 3:54 мин • July 8th, 2025
Начните с помещения предметного стекла с адгезивным цитокин-стимулированным эндотелиальным монослоем в проточную камеру.
Эти эндотелиальные клетки экспрессируют молекулы поверхностной адгезии, такие как селектины, и связанные с эндотелием миграционные сигналы, такие как хемокины.
Введите в проточную камеру лейкоциты, меченные флуоресцентными метками.
Когда лейкоциты протекают через эндотелиальный монослой, они взаимодействуют с активированными эндотелиальными клетками.
Селектины на эндотелиальных клетках связываются с соответствующими лигандами на лейкоцитах.
Селектин-лигандные взаимодействия являются слабыми и преходящими, что позволяет лейкоцитам катиться по эндотелиальному монослою под действием проточной среды.
Роллинг позволяет лейкоцитам взаимодействовать с хемокинами, активируя интегрины и способствуя стойкому аресту лейкоцитов.
Впоследствии лейкоциты распространяются по эндотелиальному монослою, что указывает на их потенциал для трансмиграции, важного шага в иммунном ответе.
Этот анализ помогает изучить механизм адгезии, расклеивания и трансмиграции лейкоцитов при их перфузии над эндотелиальными клетками.
Используйте один микромоляр зеленого флуоресцентного красителя для флуоресцентного нуклеинового кислотного окрашивания для флуоресцентного мечения лейкоцитов. После маркировки инкубируйте лейкоциты в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем центрифугируйте ячейки при 300-кратном избежании в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки.
Суспендируйте в фосфатно-солевом буфере для промывания клеток. Затем центрифугируйте клетки в 300 раз g в течение 5 минут. Исходя из скорости потока, суспендируйте 5 миллилитров клеток в буфере для анализа. Затем нагрейте водяную баню до 37 градусов по Цельсию.
Далее отложите в сторону 50-миллилитровый перфузионный шприц, и установите его на держатель шприца. Затем установите насос в режим вытяжки, при этом объем насоса равен 0 миллилитрам, а диаметр — 26,70 миллиметра. Затем прикрепите к шприцу муфту с люэровским замком, а трубку с локтевым люэровским соединителем подсоедините к муфте с люэровским замком. Затем прикрепите свободный конец трубки к проточной камере. Чтобы прикрепить лейкоциты к обездвиженным тромбоцитам, соедините предметное стекло со шприцем.
Чтобы перфузировать лейкоциты и затем прикрепиться к слою сосудистого или тромбоцитарного монослоя, прикрепите вторую трубку к 50-миллилитровой конической трубке, содержащей буфер для анализа, а затем заполните трубку с помощью пипетки объемом 1 миллилитров. Как только трубка будет заполнена, сожмите ее и подсоедините к проточной камере. Перед перфузией лейкоцитов добавьте в клеточную суспензию 3 миллимоляра хлорида кальция и 2 миллимоляра хлорида магния. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут.
Чтобы удалить возможный воздух, застрявший в камере и в трубке, перед перфузией ячеек проведите с помощью пробирного буфера. Затем сожмите трубки, чтобы закрыть конец, и переключите трубку с буфера для анализа на клеточную суспензию, тем самым предотвратив попадание пузырьков воздуха внутри.
Чтобы первые ячейки прибыли, перфузируйте ячейки с соответствующей скоростью потока и напряжением сдвига. Продолжайте перфузию ячеек, поддерживая скорость потока и напряжение сдвига в течение двух минут. Затем сделайте шесть изображений вращающихся и отпугивающих клеток в течение 2-6 минут с помощью флуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением, подключенного к цифровой камере.
Обзор
В данной статье описывается метод анализа в поточной камере для изучения адгезии и трансмиграции лейкоцитов через эндотелиальный монослой. Этот метод позволяет детально рассмотреть взаимодействия между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, что имеет решающее значение для понимания иммунных реакций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Биология сосудов
Теоретические основы
- Адгезия лейкоцитов имеет жизненно важное значение для иммунного ответа.
- Эндотелиальные клетки экспрессируют молекулы адгезии и миграционные сигналы.
- Понимание этих взаимодействий может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- Анализы в потоковой камере имитируют физиологические условия.
Цель исследования
- Изучить механизмы адгезии и трансмиграции лейкоцитов.
- Проанализировать роль селектинов и интегринов в этих процессах.
- Получить представление о динамике иммунного ответа.
Используемые методы
- Подготовка монослоя эндотелия, стимулированного цитокинами.
- Флуоресцентное мечение лейкоцитов для визуализации.
- Использование проточной камеры для имитации условий кровотока.
- Захват изображений взаимодействий лейкоцитов с эндотелиальными клетками.
Основные результаты
- Лейкоциты демонстрируют поведение качения на поверхности эндотелия.
- Взаимодействия между селектинами и лигандами являются транзиторными.
- Наблюдались плотная адгезия и распластывание лейкоцитов.
- Оценивали трансмиграционный потенциал лейкоцитов.
Выводы
- Анализ в потоковой камере эффективно моделирует взаимодействия между лейкоцитами и эндотелием.
- Полученные данные расширяют понимание поведения иммунных клеток.
- Результаты могут быть использованы в будущих исследованиях воспалительных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный анализ на основе ламинарного потока позволяет проводить динамическую характеристику взаимодействий между лейкоцитами и эндотелием в условиях физиологического напряжения сдвига, предоставляя важные сведения о механизмах привлечения иммунных клеток. Моделируя этапы адгезии, роллинга и трансмиграции, данный метод способствует валидации мишеней при исследовании воспалительных заболеваний и механистическому снижению рисков при разработке иммуномодулирующих препаратов. Количественные показатели облегчают разработку анализа для скрининга соединений, модулирующих взаимодействие лейкоцитов с эндотелием.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации селектин-опосредованного роллинга и интеграин-зависимой прочной адгезии в условиях потока.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию молекул эндотелиальной адгезии и лейкоцитарных лигандов в физиологически релевантном контексте.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков за счет установления связи между молекулярными взаимодействиями и клеточным поведением, имеющим решающее значение для иммунного ответа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых количественных данных о скорости роллинга лейкоцитов, частоте адгезии и распластывания в условиях контролируемого напряжения сдвига.
- Применение для скрининга: позволяет подготавливать валидированные эндотелиальные монослои для скрининга библиотек соединений с целью идентификации модуляторов привлечения лейкоцитов.
- Масштабируемость: поддерживает рабочие процессы визуализации со средней пропускной способностью, совместимые с флуоресцентной микроскопией и системами цифровой регистрации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: моделирует пути воспаления сосудов человека, что позволяет согласовать трансляционные биомаркеры состояний активации эндотелия.
- Доклиническая преемственность: связывает результаты первичного поиска с доклинической валидацией путем оценки влияния соединений на потенциал трансмиграции лейкоцитов.
- Принятие решений с учетом рисков: предоставляет данные для определения критериев принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе дозозависимой модуляции динамики адгезии в условиях потока.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ интегрируется в общий процесс поиска лекарственных средств — от скрининга взаимодействия с мишенью и оптимизации соединений-лидеров до оценки доклинической эффективности, в частности, для разработки иммуномодулирующих и противовоспалительных терапевтических средств.
- Открытие в биологии: обеспечивает проверку гипотез о механизмах взаимодействия лейкоцитов с эндотелием и уточнение путей передачи сигналов осей селектинов/интегринов.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу эндотелиальные системы с количественными показателями адгезии для надежной оценки соединений в ходе первичного и вторичного скрининга.
- Аналитика: предоставляет измеряемые параметры, включая поток катящихся клеток (rolling flux), силу адгезии и индекс распластывания, что позволяет проводить сравнительный анализ при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклиническими моделями за счет сохранения релевантной для человека физиологии эндотелия и специфичности подмножеств лейкоцитов.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для программ по иммунологии, биологии сосудов и исследованию воспаления в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности в путях рекрутирования лейкоцитов.
- Операционная ценность: стандартизирует условия напряжения сдвига и протоколы подготовки клеток для повышения воспроизводимости результатов в разных центрах и группами исследователей.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет более раннего получения данных о функциональном иммунном ответе в каскаде поиска новых лекарственных средств.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе профилей их взаимодействия с эндотелием.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, динамикой потока и флуоресцентной микроскопией для подготовки эндотелиального монослоя и маркировки лейкоцитов.
- Зависит от систем камер с потоком, шприцевых насосов и установок для перфузии с контролем температуры для поддержания физиологического напряжения сдвига и условий 37°C.
- Необходимо межкомандное стандартизирование протоколов изоляции лейкоцитов, эффективности маркировки и активации эндотелия для получения воспроизводимых результатов.
- Требуется учитывать особенности адаптации при расширении метода на различные подтипы лейкоцитов, источники эндотелия или патологические состояния активации.
- Ограничено необходимостью использования специализированного оборудования для визуализации и навыков количественного анализа динамических клеточных взаимодействий в потоке.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Оценка лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействий в условиях протекают в Ex Vivo Autoperfused Microflow палата Анализ
Похожие видео
0 Просмотры
Флуоресцентная маркировка красителей эритроцитов и лейкоцитов для изучения динамики потока в циркуляции сетчатки мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Microfluidic Assay для оценки лейкоцитарной адгезии к человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток (hiPSC-ECs)
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ Физиологические E-селектин-опосредованной лейкоцитов Роллинг на микрососудистой эндотелия
Похожие видео
0 Просмотры
Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке
Похожие видео
0 Просмотры
Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells
Похожие видео
0 Просмотры
Роман трехмерного течения палаты по изучению устройства хемокинами направлены Экстравазация клеток, циркулирующих в физиологических условиях потока
Похожие видео
0 Просмотры
Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига
Похожие видео
0 Просмотры
В режиме реального времени изображений эндотелиальных межклеточных соединений Во нейтрофилов Трансмиграция в физиологических Flow
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026