$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Объемная аутофагия включает в себя секвестрацию аутофагического груза и растворимых цитозольных белков, включая лактатдегидрогеназу или ЛДГ, в аутофагосомах для деградации.
Для оценки секвестрации ЛДГ, отражающей объемную аутофагическую активность, берут электропорационную кювету с клетками, испытывающими недостаток питательных веществ, обработанными ингибиторами для блокирования аутофагической лизосомальной деградации.
Выполняйте электропорацию для избирательного разрушения клеточной мембраны и высвобождения растворимых белков.
Смешайте клеточную нарушку с буферным раствором сахарозы, чтобы сохранить клеточные компоненты.
Переложите необходимый разбавленный раствор в буферную пробирку. Центрифуга для отделения несеквестрированной ЛДГ от севестрированной аутофагосомой ЛДГ.
Переложите оставшийся разведенный раствор disrupt, содержащий общую клеточную фракцию ЛДГ, в другую пробирку.
Добавьте в обе пробирки буфер, содержащий неионогенное поверхностно-активное вещество, чтобы извлечь секвестрированные и общие фракции ЛДГ.
Центрифугировать и перенести ЛДГ-содержащие надосадочную жидкость в буферсодержащие пробирки с пируватом и НАДН.
ЛДГ превращает пируват в лактат с окислением НАДГ, снижая уровень НАДН в соответствии с концентрацией ЛДГ.
Количественно оцените ЛДГ в осажденных и общих клеточных фракциях для определения секвестрации ЛДГ.
С помощью пипетки повторно суспендируйте клеточную гранулу для получения суспензии, близкой к одноклеточной. Перенесите эту суспензию на 4-миллиметровую электропорационную кювету. Поместите кювету в электропоратор с экспоненциальной волной затухания и разрядите один электрический импульс при напряжении 800 вольт, 25 микрофарадах и 400 Ом.
С помощью нового наконечника для пипетки перенесите разрушающую ее клетку в 1,5-миллиметровую микроцентрифужную пробирку, содержащую 400 микролитров ледяного раствора сахарозы с фосфатным буфером, и кратковременно перемешайте с помощью пипетирования. Повторите процесс ресуспендирования, разрушения электродов и смешивания для каждого образца. Если вы выполняете процедуру впервые, обязательно убедитесь в эффективном и избирательном разрушении электродов плазматической мембраны, как описано в тексте.
Чтобы получить осажденные фракции ЛДГ, удалите 550 микролитров из каждого разбавленного раствора, разрушенного клетками, и перенесите его в собственную 2-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую 900 микролитров ледяного ресуспензионного буфера с 0,5% BSA и 0,01% Tween-20. Пипеткой коротко перемешать. Центрифугируйте при 18 000 g и 4 градусах Цельсия в течение 45 минут для получения гранул, содержащих осажденный LDH. С помощью всасывания тщательно отсасывайте надосадочную жидкость, чтобы гранулы оставались как можно более сухими.
Храните осажденные образцы LDH при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к анализу. Для общих фракций ЛДГ перенесите 150 микролитров из каждого из разбавленных растворов, разрушенных клетками, в отдельную новую пробирку. Храните их в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к анализу.
Разморозьте как осадившиеся образцы ЛДГ, так и общие образцы ЛДГ на льду. После размораживания добавьте 300 микролитров ледяного ресуспензионного буфера, содержащего 1,5% Triton X-405, к общему количеству образцов LDH. Поверните образцы на валике в холодном помещении в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров ледяного ресуспензионного буфера, содержащего 1% Triton X-405, в осажденные образцы LDH. С помощью пипетки повторно суспендируйте гранулы до тех пор, пока раствор не станет однородным. Центрифугируйте все образцы при 18 000 g при 4 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы осадить нерастворенный клеточный мусор.
После завершения центрифугирования поместите образцы на лед. Определите уровни ЛДГ в надосадочной жидкости, используя либо классический ферментативный анализ, как описано в тексте, либо любой из широкого разнообразия коммерчески доступных наборов.