Количественная оценка активности объемной аутофагической секвестрации в клетках млекопитающих
Энциклопедия экспериментов JoVE
Иммунология
0 просмотров • 4:33 мин. • July 8th, 2025
Объемная аутофагия включает в себя секвестрацию аутофагического груза и растворимых цитозольных белков, включая лактатдегидрогеназу или ЛДГ, в аутофагосомах для деградации.
Для оценки секвестрации ЛДГ, отражающей объемную аутофагическую активность, берут электропорационную кювету с клетками, испытывающими недостаток питательных веществ, обработанными ингибиторами для блокирования аутофагической лизосомальной деградации.
Выполняйте электропорацию для избирательного разрушения клеточной мембраны и высвобождения растворимых белков.
Смешайте клеточную нарушку с буферным раствором сахарозы, чтобы сохранить клеточные компоненты.
Переложите необходимый разбавленный раствор в буферную пробирку. Центрифуга для отделения несеквестрированной ЛДГ от севестрированной аутофагосомой ЛДГ.
Переложите оставшийся разведенный раствор disrupt, содержащий общую клеточную фракцию ЛДГ, в другую пробирку.
Добавьте в обе пробирки буфер, содержащий неионогенное поверхностно-активное вещество, чтобы извлечь секвестрированные и общие фракции ЛДГ.
Центрифугировать и перенести ЛДГ-содержащие надосадочную жидкость в буферсодержащие пробирки с пируватом и НАДН.
ЛДГ превращает пируват в лактат с окислением НАДГ, сн
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео