Анализ для скрининга биоактивных наночастиц на ингибирование передачи сигналов толл-подобных рецепторов

Возьмем многолуночный планшет с различными репортерными макрофагами, содержащими секретируемый эмбриональный ген щелочной фосфатазы, или ген SEAP, или секретируемый ген люциферазы под индуцируемыми промоторами.

Добавляйте в предназначенные лунки среды, содержащие различные пептидно-золотые наночастицы, смешанные с липополисахаридами или ЛПС.

ЛПС связывается с толл-подобными рецепторами макрофагов, или TLR, вызывая интернализацию в эндосоме.

Эндосомальный протонный насос транспортирует протоны внутрь. Подкисление запускает передачу сигналов TLR, активируя факторы транскрипции.

Эти факторы индуцируют экспрессию репортерных генов, продуцирующих SEAP или люциферазу.

С другой стороны, интернализация ЛПС вместе с гибридами приводит к тому, что отрицательно заряженные пептидные группы секвестрируют люминальные протоны, предотвращая эндосомальное закисление и ингибируя передачу сигналов TLR.

Соберите среду, центрифугируйте для отделения надосадочной жидкости и добавьте субстраты для SEAP и люциферазы.

SEAP преобразует свой субстрат в цветной продукт, в то время как люцифераза катализирует его субстрат для производства люминесценции.

Снижение репортерных сигналов указывает на эффективность гибридов в ингибировании передачи сигналов TLR.

Центрифугируйте 20 объемов гибридного раствора пептида-ГНП в 1,5-миллилитровых пробирках Эппендорфа при 18 000 г в течение 30 минут. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Переложите гибриды в одну свежую пробирку, и промойте их дважды 1 миллилитром PBS. После этого повторно суспендируйте промытые гибриды в одном объеме среды R10. Смешайте равные объемы концентрированных гибридов и содержащей ЛПС среды R10 таким образом, чтобы конечная концентрация гибридов и ЛПС составляла соответственно 100 сотнях наномоляров и 10 нанограммов на миллилитр.

Далее извлеките питательную среду из культивальной пластины макрофагов. Добавьте по 100 микролитров смеси гибрид-ЛПС в каждую лунку с тремя повторами для каждого состояния. Включите отрицательный контроль и контроль LPS. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов, затем переложите среду из каждой лунки в отдельную центрифужную пробирку. Центрифугируйте пробирки при 18 000 умноженных на g при температуре 4 градуса Цельсия в течение 30 минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую круглую нижнюю пластину на 96 лунок.

Чтобы начать репортерный анализ на этих образцах, добавьте 180 микролитров предварительно подогретого раствора QUANTI-Blue в каждую лунку новой 96-луночной пластины с плоским дном, затем перенесите 20 микролитров надосадочной жидкости из каждого образца в эту пластину. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов, пока темно-синий цвет не разовьется до оптической плотности более 1. После этого используйте считыватель пластин для записи поглощения на 655 нанометрах. Затем перелейте по 10 микролитров свежей надосадочной жидкости из каждого образца в 96-луночную прозрачную белую пластину с плоским дном.

С помощью автоматического инжектора добавьте по 50 микролитров раствора люциферазы в каждую лунку и сразу же зарегистрируйте люминесценцию скважина за лункой. Затем проверьте тормозящий эффект потенциальных кандидатов и оцените специфичность TLR, как указано в текстовом протоколе.