Фокусообразующий анализ для количественного определения титров вируса в органах инфицированной мыши

Возьмите многолуночный планшет, содержащий монослой клеток млекопитающих.

Инокулируйте лунки серийными разведениями тканевых гомогенатов, содержащих вирус Зика, полученных из различных органов инфицированной мыши.

При попадании в клетки через эндоцитоз вирус размножается и отпочковывается, заражая соседние клетки.

Покрыть высоковязким раствором метилцеллюлозы, создав физический барьер, ограничивающий движение вируса.

Барьер позволяет заражать только непосредственные соседние клетки, образуя очаги инфицированных клеток, и гарантирует, что каждый очаг происходит из одной вирусной частицы, что позволяет проводить точную количественную оценку.

Фиксируют клетки и проникают в мембрану. Добавляют первичные антитела, которые проникают в клетки и взаимодействуют с вирусным антигеном.

Введите пероксидазу-конъюгированное вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом.

Добавьте хромогенный субстрат, который преобразуется пероксидазой для создания цветных пятен, указывающих на очаги инфицированных клеток.

Подсчитайте очаги, чтобы количественно оценить титр вируса в различных органах мыши.

Достаньте гомогенизированные образцы из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов Цельсия и дайте им оттаять. Положив образцы на лед, разведите вирус Зика в 10 раз в первой лунке разбавляющей пластины и используйте многоканальную пипетку для 10-кратного серийного разведения вниз по планшету, каждый раз меняя наконечники, добавляя 20 микролитров образца на 180 микролитров питательной среды.

Меняйте наконечники пипеток между каждым разведением. Подготовьте фокусообразующую пластину, удалив среду из подготовленной 96-луночной пластины с плоским дном, покрывающей клетки Vero. Чтобы монослой не пересыхал, сразу же добавьте по 100 микролитров разведения вируса в каждую лунку в пластине Vero. Используйте тот же набор советов, чтобы добавить от самой низкой к самой высокой концентрации.

Скальные плиты переворачивают из стороны в сторону от 2 до 4 раз и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного-двух часов. Прогрейте 2% метилцеллюлозу до комнатной температуры. Затем разведите 2% раствор метилцеллюлозы в питательных средах в соотношении примерно 2 к 1. После инкубации добавьте по 125 микролитров питательной среды метилцеллюлозы в каждую лунку из 96-луночных планшетов. Снова инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 32-40 часов.

Чтобы зафиксировать клетки Vero, в шкафу биобезопасности добавьте 50 микролитров 5% параформальдегида поверх слоя метилцеллюлозы в каждой лунке из 96-луночных планшетов. Выдерживать в течение 60 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы накройте тарелки парапленкой, и поместите их при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

После этого с помощью пипетки удалите накладку и медиа с клеток в одноразовый контейнер внутри шкафа биобезопасности. Аккуратно промойте 150 микролитрами PBS на лунку. Снимите PBS с пластин и выньте пластину из шкафа биобезопасности. Повторите промывку PBS дважды. Затем добавьте 150 микролитров на лунку одноразовый буфер для промывки FFA и оставьте при комнатной температуре на 5-10 минут, чтобы пропитать неподвижные клетки.

Затем используйте первичное антитело к вирусу Зика для обнаружения инфекции. Приготовьте первичное антитело 4G2 в концентрации 1 мкг на миллилитр в буфере для окрашивания СЖК. Снимите промывочный буфер FFA с планшетов и добавьте 50 микролитров первичного антитела в буфере для окрашивания FFA в каждую лунку. Затем запечатайте пластины парапленкой или полиэтиленовой пленкой, и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

Приготовьте вторичное антитело козы против мыши, меченное HRP, в концентрации от 1 до 5000 в буфере для окрашивания FFA. После удаления раствора антитела промойте клетки три раза 150 микролитрами буфера для промывки СЖК на лунку. Снимайте буфер для стирки, каждый раз вставляя его в раковину.

Окрашивайте клетки вторичным антителом в буфере для окрашивания СЖК в количестве 50 микролитров на лунку и инкубируйте от одного до двух часов при комнатной температуре. После этого снова трижды промойте ячейки с помощью буфера для промывки FFA, каждый раз снимая буфер для стирки, щелкая в раковине.

Добавьте по 50 микролитров субстрата Trueblue в каждую лунку. Подождите от 2 до 15 минут, пока пятна не станут полностью определенными с минимальным фоном. После того, как пятна станут видны, аккуратно промойте их водой, используя руку, чтобы защитить монослой от силы текущей воды. Высушите в кране на бумажных полотенцах.

Вскоре после этого используйте препарирующий эндоскоп для ручного подсчета пятен в каждой скважине или используйте автоматический счетчик пятен. В программном обеспечении иммунозахвата выберите разведение с легко различимыми очагами от 20 до 200 на лунку для каждого образца и рассчитайте титр в фокусообразующих единицах на миллилитр, используя среднее значение дубликатов лунок.