Оценка антимикробного потенциала бактериоцинпродуцирующих изолятов фекальных бактерий мышей

Возьмите суспензию фекалий мыши, содержащую молочнокислые бактерии, или LAB, которые продуцируют бактериоцин, антимикробный пептид, и инокулируют в предварительно подогретую селективную мягкую агаровую среду LAB.

Вылейте среду в агаровую пластину, сформировав первый слой.

Наложите второй слой агара и инкубируйте.

Первый слой избирательно способствует росту LAB, позволяя секретируемым молекулам бактериоцина диффундировать наружу из колоний в окружающую среду.

Второй слой содержит бесклеточную среду, которая обеспечивает диффузию бактериоцина и предотвращает рост колоний LAB на поверхности.

Теперь насыпьте третий слой агара, содержащий штамм, чувствительный к бактериоцину.

Бактерии, растущие в третьем слое, сталкиваются с бактериоцином, диффундирующим из нижних слоев.

Бактериоцин разрушает клеточную мембрану чувствительных бактерий, нарушая клеточный гомеостаз и приводя к гибели клеток, видимой в виде прозрачной зоны на третьем слое.

Измерьте диаметр зоны, чтобы оценить активность бактериоцина.

Для подсчета бактериоцин-продуцирующих бактериальных клеток в образцах кала переносят разведенные клетки бактериоцина-продуцента в 4 миллилитра предварительно подогретого мягкого агара MRS. Перемешайте агар с помощью вортекса и вылейте ячейки на пластину MRS 1,5% агара. Этот слой называется первым слоем.

Перенесите еще 4 миллилитра бесклеточного 0,8% мягкого агара MRS на первый слой, чтобы внедрить все клетки в мягкий агар. Этот слой предназначен для предотвращения роста клеток в виде колоний на поверхности агаровых пластин.

В стерильном колпаке высушите пластины, сняв крышку на пять-10 минут, прежде чем инкубировать пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 20-24 часов для роста клеток и образования колоний.

Чтобы выявить колонии, продуцирующие бактериоцин, смешайте 40 микролитров ночной культуры соответствующего индикаторного штамма с 4 миллилитрами предварительно подогретого мягкого агара для каждой пластины. Разлить смесь по тарелкам. Этот слой называется третьим слоем.

Высушите и инкубируйте планшеты, как и раньше, для роста клеток и формирования колоний. Колонии, продуцирующие бактериоцин, имеют четкие зоны ингибирования вокруг колоний.