Анализ in vitro для количественной оценки внутриклеточного роста паразита в макрофагах

Возьмите две микропланшеты, содержащие покровные стекла с макрофагами, полученными из костного мозга или BMM.

Добавьте метациклические промастиготы Leishmania — удлиненную жгутиковую стадию — в одну пластину и амастиготы — овальную нежгутиковую стадию — в другую.

Во время инкубации паразиты связываются с рецепторами макрофагов, запуская рецептор-опосредованный фагоцитоз.

Фагосома сливается с лизосомами и везикулами, полученными из эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, созревая в паразитофорную вакуоль.

Пониженный pH вакуоли запускает дифференцировку промастиготы в амастиготу и ее репликацию.

Промойте для удаления неукоренившихся паразитов.

Исправьте зараженные макрофаги и добавьте моющее средство, чтобы проникнуть в клетки и паразитов.

Введите флуоресцентный краситель нуклеиновой кислоты для окрашивания ядер макрофагов и паразитов.

Закрепите покровные стекла на предметных стеклах и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом, количественно определяя более крупные ядра хозяина и окружающие их более мелкие ядра амастигота.

Сравните количество амастигот, чтобы оценить их размножение в макрофагах, первоначально инфицированных недифференцированными промастиготами и инфицированных репликативными амастиготом.

Чтобы заразить клетки L. amazonensis, разбавьте суспензию паразита до соответствующей экспериментальной кратности инфекции и добавьте от 50 до 100 микролитров паразитов в каждую лунку всех 6-луночных планшетов, включая все временные точки эксперимента. Инкубируйте макрофаги, полученные из костного мозга, в течение соответствующего периода инфекции и соответствующей температуры. Затем трижды промойте лунки 2 миллилитрами свежего 37 градусов Цельсия PBS без кальция или магния на лунку, и зафиксируйте исходную временную точку образца от 1,5 до 2 миллилитров 2% параформальдегида на 10 минут.

Для планшетов, соответствующих более поздним временным точкам, добавьте в каждую лунку по 2 миллилитра свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга, и верните планшеты в соответствующий инкубатор. Затем зафиксируйте и промойте ячейки для каждого оставшегося момента времени, как показано выше, и храните образцы при температуре 4 градуса Цельсия в свежем PBS.

Чтобы окрашивать клетки DAPI, замените надосадочную жидкость на 1,5 миллилитра свежего PBS без кальция и магния, дополненную 0,1% неионогенным моющим средством на 10 минут при комнатной температуре, после чего последует три 2-миллилитровых промывания PBS без кальция или магния. Далее окрашивают клетки 2 микрограммами на миллилитр DAPI в 1 миллилитр PBS на 1 час при комнатной температуре.

После трех стирок поместите покровные стекла клеточной стороной вниз на отдельные предметные стекла микроскопа, на которых установлен имеющийся в продаже реагент для монтажа, предотвращающий выцветание. Затем, чтобы количественно определить количество инфицированных клеток, используйте 100-кратный иммерсионный масляный объектив флуоресцентного микроскопа и счетчик Эмануэля, чтобы определить количество более мелких ядер амастиготов, сгруппированных вокруг каждого большого ядра макрофага, окрашенного DAPI.