Анализ высвобождения красителя для количественной оценки ферментативной активности антимикробных белков

Начните с тюбика, содержащего термически убитую бактериальную суспензию и обработайте раствором красителя.

Молекулы красителя ковалентно связываются с пептидогликаном — важным компонентом клеточной стенки бактерии, придавая ей синюю окраску.

Гранулируйте бактерии и удалите надосадочную жидкость, содержащую несвязанные молекулы красителя.

Ресуспендируйте бактерии и введите в пробирку раствор антимикробного белка, запуская ферментативный гидролиз бактериального пептидогликана, что приводит к деградации клеточной стенки с последующим лизисом клеток.

Это приводит к высвобождению молекул красителя, придающих ему синюю окраску.

Добавьте этанол — денатурирующее белок средство, инактивирующее антимикробные белки и завершающее ферментативную реакцию.

Центрифугируйте содержимое для гранулирования фрагментов клеток и ферментов. Перенесите молекулу красителя надосадочную жидкость на многолуночный планшет.

С помощью считывателя пластин измерьте поглощение на 595 нанометрах.

Сравните абсорбцию образца, обработанного ферментом, с абсорбцией образца, не обработанного ферментом, чтобы количественно оценить ферментативную активность антимикробного белка.

В анализе высвобождения красителя субстрат ковалентно связывается с красителем Remazol Brilliant Blue R или RBB. Начните этот протокол с изготовления 200-миллимолярного раствора RBB. Растворите 1,25 грамма RBB в свежеприготовленном растворе гидроксида натрия.

Далее ресуспендируют убитые теплом бактериальные клетки в концентрации 0,5 грамма сырого веса в 30 миллилитрах раствора RBB. Для очищенного пептидогликана ресуспендировать пептидогликан в концентрации 0,3 грамма сырой массы и 30 миллилитров раствора RBB.

Поскольку последующие этапы являются одинаковыми независимо от используемого субстрата, мечение будет продемонстрировано только для бактериальных клеток. Инкубируйте реакционную смесь на вращающейся платформе в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия с помощью осторожного перемешивания. Через шесть часов перенесите реакционную смесь в инкубатор с температурой 4 градуса Цельсия и инкубируйте еще 12 часов при бережном перемешивании.

Когда инкубация будет завершена, соберите окрашенный субстрат путем центрифугирования при 3000-кратном g в течение 30 минут. Сцедите раствор красителя из гранул субстрата. Тщательно суспендируйте гранулу в воде типа 1 с последующим центрифугированием. Промойте таким образом клетки, помеченные красителем, от трех до пяти раз, чтобы удалить нековалентно связанный растворимый краситель с субстратов.

Для заключительных промывок переложите часть гранул, которая будет использоваться в анализе высвобождения красителя, в микропробирки объемом 1,5 миллилитра. Надосадочная жидкость последней смывки должна быть прозрачной, при этом субстрат остается синим. Храните окрашенный субстрат во взвешенном состоянии в минимальном количестве воды при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

Чтобы подготовиться к анализу высвобождения красителя, дайте замороженному окрашенному субстрату вернуться к комнатной температуре и дважды промойте буфером для анализа, который был эмпирически определен для фермента. В этом случае используется PBS. Рассчитайте объем необходимой субстратной суспензии, умножив объем реакции в 200 микролитров на количество анализов выделения красителя, которые необходимо выполнить.

Чтобы приготовить суспензию субстрата, сначала добавьте окрашенный субстрат до соответствующего объема PBS. Сделайте разведение один к одному и произведите начальное измерение оптической плотности на 595 нанометрах с помощью PBS в качестве заготовки. Добавляйте в суспензию постепенное количество окрашенной подложки до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность 2,0 на 595 нанометрах.

В этой демонстрации анализ высвобождения красителя будет использоваться для определения оптимальных условий инкубации белкового противомикробного препарата. Во-первых, приготовьте стоковую белковую противомикробную суспензию, отрегулировав концентрацию до 1 миллиграмма на миллилитр с помощью PBS, как описано в тексте протокола. Затем разведите стоковый белок антимикробной суспензии до концентрации 100 нанограмм на микролитр.

Эта концентрация дает конечную реакционную массу 1 микрограмм белка на объем, добавляемый в реакцию анализа. Проведите анализ реакции в микрофуже-пробирках объемом 0,5 миллилитра для оценки теплового диапазона. Для каждого термического условия добавьте 10 микролитров исходного белка в 200 микролитров приготовленной суспензии субстрата.

Инкубировать в термоамплификаторе в течение восьми часов с перемешиванием методом инверсии один раз в час. После инкубации остановите реакции, добавив по 25 микролитров этанола в каждую микрофугированную пробирку. Чтобы удалить непереваренный нерастворимый субстрат, центрифугируйте при 3 000 раз g в течение двух минут. После этого, стараясь не нарушить гранулу непереваренного субстрата, перенесите 150 микролитров надосадочной жидкости для каждой реакционной смеси на 96-луночный микропланшет с плоским дном.

Чтобы количественно оценить ферментативную активность, используйте микропланшетный спектрофотометр для измерения поглощения надосадочной жидкости на 595 нанометрах. Повышенная абсорбция растворимым красителем, высвобождаемым в надосадочную жидкость из меченого субстрата, является количественным измерением ферментативной активности.