Анализ с помощью точечной пластины для оценки реакций на окислительный стресс у штаммов бактерий

Обрабатывайте как пиомеланин, так и непиомеланин-продуцирующие штаммы бактерий с помощью тест-агента.

Пиомеланин, внеклеточный пигмент, обеспечивает защиту от окислительного стресса.

Тест-агент нарушает биосинтез пиомеланина, снижая его выработку.

После инкубации выполните серийное бактериальное разведение с помощью буфера, содержащего тестируемый агент или растворитель транспортного средства.

Пятнистые бактериальные разведения на агаровых пластинах с различной концентрацией перекиси водорода — окислительного стресса.

Пластины, в которых отсутствует перекись водорода, служат контрольными.

инкубировать. В контрольных пластинах бактерии образуют колонии.

В необработанном штамме, продуцирующем пиомеланин, пиомеланин защищает бактерии от окислительного повреждения, вызванного перекисью водорода, что приводит к образованию пигментированных колоний.

Тем не менее, штамм, продуцирующий пиомеланин, обработанный тест-агентом, проявляющий восстановленный пиомеланин, становится чувствительным к окислительному стрессу, что приводит к гибели бактерий.

Подсчитайте колонии.

Уменьшение количества и размера колонии при увеличении концентрации перекиси водорода у обработанных штаммов, продуцирующих пиомеланин, а также обработанных и необработанных штаммов, не продуцирующих пиомеланин, по сравнению с контрольной группой, указывает на повышенную чувствительность бактерий к окислительному стрессу.

Чтобы начать эту процедуру, в течение ночи проводят посевы штаммов, подлежащих тестированию в LB, с NTBC и без него. На следующий день приготовьте агаровые пластины LB, содержащие перекись водорода в качестве окислительного стрессора. Сначала расплавьте колбы с агаром LB и охладите среду примерно до 50 градусов Цельсия при комнатной температуре.

Далее добавьте перекись водорода непосредственно в охлажденную среду в нужных концентрациях. Перемешайте колбу и перемешайте. Диапазон концентраций перекиси водорода от 0 до 1 миллимольяра является хорошей отправной точкой. Сразу же залейте пластины и обжарьте поверхность, чтобы удалить пузырьки. Выход составляет четыре пластины на 100 миллиметров LB агара. Отметьте на пластинах концентрацию перекиси водорода.

Поместите незакрытые пластины в биологический колпак с вентилятором, работающим в течение 30 минут, чтобы удалить лишнюю влагу с пластин. Тарелки следует использовать в тот же день, когда они были приготовлены. Пока пластины сохнут, вымойте и измерьте внешний диаметр 600 ночных культур.

Нормализуйте OD600 для всех ночных культур до минимального значения для тестируемого набора штаммов. Для этого определяют объем культуры, необходимый для разведения культуры до наименьшего OD600 в общем объеме 1 миллилитр.

Например, если культура имеет OD600, равный 3, а самый низкий OD600 для набора штаммов равен 2,5, выполните следующий расчет, в результате которого потребуется 0,833 миллилитра в качестве необходимого объема культуры. Поместите 0,833 миллилитра культуры в микрофугальную пробирку. Затем рассчитайте количество LB плюс NTBC или LB плюс DMSO, необходимое для доведения объема культуры до 1 миллилитра. В данном примере количество составит 0,167 миллилитра. Перемешайте путем вортексинга.

Чтобы поддерживать культуры в постоянной концентрации NTBC или DMSO, выполняйте 10-кратное серийное разведение нормализованных ночных культур в PBS плюс NTBC или PBS плюс DMSO. Производите стандартные решения PBS плюс NTBC и PBS плюс DMSO в сторону увеличения или уменьшения в зависимости от количества тестируемых штаммов.

Для одного набора разведений для одного штамма смешайте 300 микромоляров NTBC или эквивалентный объем ДМСО с PBS, чтобы получить общий объем 720 микролитров. Добавьте 90 микролитров PBS плюс NTBC или PBS плюс DMSO в соответствующие микрофуговые пробирки, помеченные от 10 до минус 10 до минус 7 серийных разведений. Добавьте 10 микролитров культуры в соответствующую пробирку для разведения 10 к минус 1.

Перемешайте путем вортекса и перенесите 10 микролитров из 10 в минус 1 в пробирку для разбавления от 10 до минус 2. Меняя наконечники пипеток между разведениями, повторяйте до тех пор, пока не будут выполнены все разведения.

Нанесите 5 микролитров из 10 до минус 3 через минус 10 до минус 7 разведений на пластинах LB плюс перекись водорода в двух экземплярах для каждого штамма. Используйте один наконечник для дозатора, если пятна покрыты для наиболее разбавленного до минимального разбавления. Не наклоняйте и не наклоняйте тарелку, пока жидкость не высохнет в тарелке. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия. От 24 до 48 часов, в зависимости от штамма. Как только появятся колонии хорошего размера, сфотографируйте пластины с помощью ПЗС-камеры над трансиллюминатором.