Анализ биопленки с помощью штифтовой пластины для скрининга антибактериальных агентов

Возьмите планшет для микротитров с крышкой с цилиндрическими опорами, или колышками, покрытыми бактериальными биопленками.

Поместите колышек с биопленочным покрытием на лунки микротитровальных пластин с буфером для удаления слабо прикрепленных или планктонных бактерий, уделяя особое внимание измерениям, прикрепленным к биопленке.

Перенесите промытую крышку, покрытую биопленкой, на пробную пластину с увеличивающейся концентрацией антибактериального агента. Инкубировать без встряхивания.

В зависимости от концентрации и антибактериального потенциала агента он нарушает метаболическую активность бактерий и целостность биопленки.

После инкубации поместите колышек на лунки, содержащие буферные пластины, чтобы удалить планктонные бактерии.

Перенесите его в лунки микротитровальной пластины со средой для восстановления биопленки, содержащей резазурин, проницаемый для клеток, слабофлуоресцентный краситель. Инкубировать.

В метаболически активных бактериях ферменты дегидрогеназы восстанавливают резазурин синего цвета до флуоресцентного резоруфина розового цвета.

Отсутствие конверсии резазурина указывает на эрадикацию биопленки, в то время как конверсия в резоруфин предполагает наличие жизнеспособных клеток.

Самая низкая концентрация испытуемого антибактериального агента, не дающая конверсии резазурин, означает минимальную концентрацию, уничтожающую биопленку.

Возьмите свежий планшет на 96 лунок и добавьте 100 микролитров CRPMI, уравновешенных до комнатной температуры, в каждую лунку рядов от B до H. Разведите до четырех испытуемых соединений отдельно в 1,0 миллилитрах CRPMI до 2-кратной желаемой конечной концентрации. Добавьте 200 микролитров соединения 1 в лунки А1-А3, 200 микролитров соединения 2 в лунки А4-А6, 200 микролитров соединения 3 в лунки А7-А9 и 200 микролитров 4-го соединения в лунки А10-А12.

Последовательно разбавляйте исследуемые соединения с помощью многоканальной пипетки. Начните с переноса 100 микролитров из ряда А в ряд Б и перемешайте. Таким образом, продолжайте переливать 100 микролитров от скважины к скважине. Перемешивайте после каждой пересадки и останавливайтесь в ряду F. После смешивания вылейте 100 микролитров из ряда F в контейнер для отходов. Не переливайте жидкость в ряды G и H. Наконец, добавьте по 100 микролитров CRPMI в каждую лунку планшета с помощью многоканальной пипетки, чтобы довести конечный объем до 200 микролитров.

Добавьте 200 микролитров фосфатно-солевого буфера в свежий стерильный 96-луночный планшет, который имеет лунки с размерами, идентичными размерам планшета для инициации биопленки. Далее снимите полиэтиленовый пакет и парафиновую пленку с инициирующей пластины инкубируемой биопленки. Поднимите крышку прямо вверх, избегая контакта между колышками и дном пластины, так как это может повредить биопленку. Оставьте нижнюю часть для последующего анализа наружного диаметра₆₀₀.

Промойте планктонные клетки, положив колышковую крышку на пластину с PBS. Погрузите колышки на 5 секунд, поднимите их из PBS и погрузите еще раз, стараясь не ударить колышки о стенки колодца. Поместите промытую крышку с колышком в рабочую пластину. Избегайте ненужного контакта между колышками и нижней пластиной, так как это приведет к повреждению биопленки, что приведет к нестабильным результатам.

Заклейте тарелку парафиновой пленкой, и поместите в герметичный полиэтиленовый пакет, как и раньше. Инкубируйте планшет без встряхивания в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом. Возьмите дно инициирующей пластины биопленки и повторно суспендируйте бактерии в каждой лунке с помощью многоканальной пипетки. Измерьте наружный диаметр₆₀₀ с помощью подходящего считывателя микропланшетов, чтобы подтвердить, что рост происходит во всех лунках, но стерильность контролируется в ряду H.

Используйте планшетный считыватель, оснащенный инкубационной камерой и способный снимать показания кинетической флуоресценции для обнаружения преобразования резазурина. Настройте 24-часовое измерение кинетической флуоресценции с использованием 530-нанометрового возбуждения и 590-нанометрового излучения. Установите температуру в камере на 37 градусов Цельсия и заставляйте пластину считывать показания каждые 20 минут.

Установите считыватель пластин так, чтобы измерять от нижней части пластины, в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьтесь к мытью тарелки, добавив по 200 микролитров PBS в каждую лунку стерильной 96-луночной пластины с многоканальной пипеткой. Затем готовят среду для восстановления биопленки, добавляя 400 микролитров 0,8 мг на миллилитр стокового раствора резазурина к 20 мл среды CRPMI, до конечной концентрации 16 мкг на миллилитр резазурина.

Далее добавьте 150 микролитров среды для восстановления биопленки с помощью многоканальной пипетки, в каждую лунку свежей 96-луночной пластины. Перенесите контрольную пластину из инкубатора в шкаф для биобезопасности и осторожно снимите пластиковый пакет и герметизирующую пленку. Снимите колышки с контрольной пластины и промойте планктонные клетки в PBS, как и раньше, сохранив нижнюю часть контрольной пластины для последующего анализа наружного диаметра₆₀₀.

После промывки поместите колышковую крышку на дно пластины, содержащее среду для восстановления биопленки. Оберните боковую сторону плиты парафиновой пленкой, стараясь не загромождать дно по периметру колодцев. Сразу после упаковки планшета поместите его на считыватель пластин и начните кинетическое считывание в течение 24 часов, инициируя ранее созданный кинетический протокол резазурина.