Флуоресцентный анализ in vitro для измерения эффективности повторного герметизации плазматической мембраны

Возьмите микропланшет, содержащий клетки млекопитающих, на льду.

Добавьте среду, содержащую кальций, в выбранные лунки и среду без кальция в остальные.

Ввести мономеры бактериального порообразующего токсина. Низкая температура препятствует агрегации мономеров, способствуя связыванию с холестерином клеточной мембраны.

Инкубируют при физиологической температуре, позволяя связанным с холестерином мономерам олигомеризоваться и внедриться в мембрану, образуя пору.

В лунках с внеклеточным кальцием поры вызывают приток кальция.

Приток вызывает экзосомальное выделение токсина и повторное герметизацию мембраны.

Внутриклеточное увеличение кальция также индуцирует лизосомальный экзоцитоз, высвобождая фермент, который превращает сфингомиелин мембраны в церамид.

Обогащенная керамидами мембрана запускает токсинный эндоцитоз, восстанавливая мембрану.

Повторное уплотнение мембраны затруднено в лунках без внеклеточного кальция.

Добавьте йодид пропидия или PI — флуоресцентный краситель — который не может проникнуть в клетки с восстановленной мембраной, но проникает в поврежденные клетки для связывания ДНК, излучая флуоресценцию.

Измеряйте флуоресценцию через определенные промежутки времени, чтобы оценить эффективность повторного герметизации мембраны.

Чтобы настроить высокопроизводительный флуоресцентный анализ для разрешительных условий восстановления, промойте клетки два раза 200 микролитрами среды 37 градусов Цельсия М1 на лунку и добавьте 100 микролитров свежей среды 37 градусов Цельсия М1 с добавлением 30-микромолярного йодида пропидия после второй промывки.

Для устранения ограничительных условий следует однократно промыть клетки 200 микролитрами среды 37 градусов Цельсия М2 с добавлением 5-миллимолярной EGTA на лунку, а затем однократно промыть 200 микролитрами только среды М2.

После сброса второй промывки добавьте 100 микролитров свежей среды 37 градусов Цельсия М2 с добавлением 30-микромолярного йодида пропидия на лунку. Затем сфотографируйте пластину под проходящим светом, GFP и PI, как показано на рисунке. Пока пластина визуализируется, поместите на лед 96-луночный полипропиленовый микропланшет с круглым дном и настройте пластину так, как только что было показано для предыдущей пластины.

Для восстановительных условий добавьте 100 микролитров ледяной среды М1 с добавлением 60 микромоляров йодида пропидиума на лунку с последующим добавлением 100 микролитров ледяного М1 с 4-кратным листериолизином О или без него на лунку.

Для ремонтных ограничительных условий добавьте 100 микролитров ледяной среды М2 с добавлением 60 микромоляров йодида пропидиума на лунку, с последующим добавлением 100 микролитров ледяного М2 с 4-кратным листериолизином О или без него на лунку.

Крайне важно готовить листериолизин О в соответствующей экспериментальной концентрации на льду примерно за 5 минут до начала кинетического анализа, когда планшет 1 находится на льду, а планшет 2 готовится.

Когда первая пластина закончит нанесение, немедленно перенесите пластину на лист алюминиевой фольги на лед. Через 5 минут перелейте по 100 микролитров из каждой лунки второй пластины в соответствующую лунку в первой охлаждаемой пластине, вставив наконечники пипеток ниже мениска раствора в каждую лунку перед выбросом объема без перемешивания для правильного распределения токсина.

Дайте токсину соединиться с клетками-хозяевами в течение 1 минуты и немедленно перенесите первую пластину на считыватель планшетов для посткинетического анализа в режиме спектрофлуориметра. В конце кинетического анализа немедленно получите посткинетическую визуализацию изображения пластины, как показано при прекинетической визуализации.