Иммуногистохимическое окрашивание для выявления антигенов вируса бешенства

Начните с предметного стекла с фиксированным формалином, залитым парафином срезом ткани мозга мыши, инфицированной вирусом бешенства. Неподвижный участок удерживает вирусные антигены посредством сшивки белков.

Обработайте предметное стекло раствором ксилола, чтобы удалить парафин.

Погрузите предметное стекло в уменьшающуюся концентрацию этанола, чтобы регидратировать ткань, сделав ее совместимой с водными растворами.

Введите буфер, содержащий протеазу, для разрушения белковых сшивок, улучшая доступность антигена.

Погрузите в перекись водорода для блокирования эндогенных пероксидаз и нанесите блокирующий раствор для предотвращения неспецифических взаимодействий.

Вводят первичные антитела, специфичные к антигену бешенства, образуя комплексы антиген-антитела.

Добавьте биотинилированные вторичные антитела, которые связываются с первичными антителами. Инкубируют со стрептавидин-конъюгированными ферментами пероксидазой, которые взаимодействуют с биотином.

Введите пероксидазный субстрат, получив пурпурно-красный осадок.

Нанесите на ткань противостоящий ядерный краситель, а затем посыпайте ядра синим цветом.

Иммуногистохимическое изображение выявляет пурпурно-красные пятна в цитоплазме, подтверждающие наличие антигенов бешенства в тканевом срезе.

С помощью микротома сделайте парафиновый срез толщиной 5 микрометров. Плаваем секцию на водяной бане при температуре 38 градусов Цельсия, и собираем ее на стеклянных предметных стеклах. Пометьте слайды ручкой, устойчивой к реагентам. Выложите слайды на противень и растопите в духовке при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия в течение часа.

Затем достаньте горки из духовки и сразу же депарафинизируйте их, используя три последовательных полоскания ксилолом по пять минут каждое. После этого регидратируйте секции на предметном стекле путем последовательного погружения в уменьшающиеся разведения этанола до деионизированной воды, как указано в текстовом протоколе.

Обработайте предметные стекла протеазой в течение 30 минут для извлечения протеолитического антигена, затем промойте предметные стекла в PBST в течение 10 минут и обработайте их 3% перекисью водорода в течение 10 минут. После этого снова промойте горки PBST в течение 10 минут.

Для начала извлеките одно предметное стекло из буфера, убедившись, что вы работаете только с одним предметным стеклом за раз, в то время как остальные остаются погруженными, и используйте бумажное полотенце, чтобы промокнуть излишки буфера вокруг участка ткани. Поместите предметные стекла в камеру влажности и выдерживайте с обычной сывороткой коз при комнатной температуре в течение 15 минут.

Далее инкубируйте предметные стекла в камере влажности с оптимальным заранее определенным разведением первичных антител против бешенства и отрицательных контрольных антител при комнатной температуре в течение 60 минут без промывки между ними. После этого промыть предметные стекла PBST в течение 10 минут, и инкубировать в камере влажности с биотинилированным антителом при комнатной температуре в течение 15 минут.

Снова промойте горки PBST в течение 10 минут. Инкубировать предметные стекла в камере влажности с комплексом стрептавидин-HRP при комнатной температуре в течение 15 минут, а ПБСТ промыть в течение 10 минут. Затем инкубируйте с AEC в камере с влажностью при комнатной температуре в течение 10 минут. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 10 минут и закрасьте гематоксилином Гилла, разведенным в соотношении 1:2 с деионизированной водой в течение двух минут.

После этого смойте излишки гематоксилина, окунув предметные стекла в деионизированную воду. Промойте предметные стекла в водопроводной воде Scott's в течение 30 секунд и промойте в деионизированной воде в течение 10 минут. Снимайте слайды по одному и устанавливайте их с помощью водорастворимого монтажного носителя. Затем используйте световой микроскоп для чтения слайдов.