$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните со предметного стекла, содержащего фиксированные формалином, депарафинизированные и регидратированные биопсийные срезы височной артерии с инфильтрированными иммунными клетками, включая лимфоциты и макрофаги.
Активированные макрофаги экспрессируют рецептор фолиевой кислоты бета или FR-β — маркер, связанный с заболеванием, дифференцируя макрофаги от других иммунных клеток.
Перенесите предметное стекло в предварительно нагретый буфер для извлечения поверхностных рецепторов.
Обработайте срез перекисью водорода, блокируя внутриклеточную активность пероксидазы.
Введите смесь первичных антител, нацеленных на CD3, CD68 и FR-β, которые связываются с иммунными клетками, экспрессирующими эти белки.
Добавить биотинилированные вторичные антитела, взаимодействующие с первичными антителами, и промыть.
Покрытие стрептавидин-конъюгированными ферментами, которые связываются с биотином.
Обрабатывают хромогенным субстратом, который взаимодействует с ферментами, образуя локализованные коричневые осадки.
Ввести противокраситель — гематоксилин, окрашивая ядра в синий цвет.
Микроскопически идентифицируют маленькие, круглые, окрашенные в коричневый цвет клетки как CD3-экспрессирующие лимфоциты, а большие, нерегулярные, окрашенные в коричневый цвет клетки как CD68 и макрофаги, экспрессирующие FR-β.
Количественно оцените макрофаги в этом разделе, чтобы найти их соотношение среди общего числа инфильтрированных иммунных клеток.
Для забора антигена переложите штатив в стеклянную емкость с 200 микролитрами 95 градусов Цельсия, 10 миллимолярами на литр, цитратным буфером на 30 минут. По окончании инкубации дайте предметным стеклам остыть до комнатной температуры в течение 20 минут, а затем промойте проточной водой в течение пяти минут.
Чтобы удалить эндогенную активность пероксидазы, сначала с помощью гидрофобного маркера нарисуйте круг вокруг каждого образца ткани, а затем инкубируйте образцы в 200 микролитрах 3% перекиси водорода в течение 10 минут, а затем промывка в 200 микролитрах трис-буферного солевого раствора или ТССС на промывку. После последнего промывки аккуратно промокните каждое предметное стекло, чтобы удалить излишки буфера, и добавьте 200 микролитров основного интересующего коктейля антител и защитного стекла на каждое предметное стекло для часовой инкубации во влажной камере при комнатной температуре.
По окончании инкубации выбросьте покровные стекла и промойте стекла тремя двухминутными стирками в свежем TBSS. После удаления избытка буфера добавьте 200 микролитров соответствующего биотинилированного раствора вторичного антитела и покровную крышку на каждое предметное стекло для 45-минутной инкубации во влажной камере при комнатной температуре. После того, как вы выбросите покровные стекла, промойте слайды TBSS, как показано на рисунке. Удалите лишний буфер.
Поместите секции с 200 микролитрами субстрата DAB в буфер на 10 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации вымыть предметные стекла ТБСС и проточной водой из-под крана в течение 10 минут, перед этим провести противостоятельное окрашивание гематоксилином в течение трех минут. Затем добавьте 70 микролитров подходящей монтажной среды в каждую заслонку и медленно накиньте стеклянную защитную крышку на монтажную среду, чтобы избежать образования пузырей при опускании защитного стекла на место.
Для гистопатологического анализа поместите предметное стекло на предметное стекло светового микроскопа и оцените сосудистую архитектуру первого среза ткани. Затем количественно оцените количество макрофагов относительно количества лимфоцитов на срез.