Усовершенствованный метод сшивки иммунопреципитации для эффективной идентификации белок-связанной РНК в яичках мышей

Возьмите свежесобранные яички мыши в охлажденном буфере. Удалите белочную оболочку, фиброзный слой ткани.

Растирайте яички, чтобы освободить семенные канальцы, содержащие зародышевые клетки и клетки Сертоли.

Добавьте буфер и подвергните канальцы воздействию ультрафиолетового излучения для необратимого сшивания РНК с ассоциированными белками, сохраняя взаимодействия.

Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте канальцы в буфере для лизиса, содержащем РНКазу и ингибиторы протеазы.

Обрабатывают ткань ультразвуком, высвобождая комплексы белок-РНК и другие внутриклеточные компоненты. Ингибиторы РНКазы и протеазы инактивируют эндогенные РНКазы и протеазы.

Добавьте ДНКазу для деградации ДНК. Вводите разбавленную РНКазу для частичного расщепления РНК.

Центрифугировать и перенести надосадочную жидкость, содержащую комплексы РНК-белок, в покрытый антителами раствор магнитных шариков с высокой специфичностью к целевому РНК-связывающему белку.

Примените магнитное поле для разделения связанных с гранулами комплексов белок-РНК. Выбросьте надосадочную жидкость.

Постирайте с буфером. Магнитным путем разделяют комплексы белок-РНК и используют их для дальнейшего анализа взаимодействия РНК-белка.

Чтобы начать эту процедуру, соберите около 100 миллиграммов семенников у мышей соответствующего возраста для каждого эксперимента с иммунопреципитацией. Поместите салфетки в ледяную PBS. С помощью пинцета с тонким кончиком аккуратно удалите белочную оболочку. Добавьте 3 миллилитра ледяного PBS в кофемолку для салфеток и используйте стеклянный пестик, чтобы растирать ткань с помощью мягкой механической силы. Далее переложите тканевую суспензию в чашку для клеточной культуры, и добавьте ледяной PBS до 6 миллилитров. Быстро встряхните тарелку, чтобы жидкость равномерно покрыла дно блюда.

Сшиваем суспензию на льду три раза с коэффициентом 400 миллиджоулей на квадратный сантиметр при 254 нанометрах. Обязательно перемешивайте суспензию между каждым облучением, затем соберите суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте при 1200 умноженных на g и 4 градусах в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре PBS. После этого переложите суспензию в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 1000 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение двух минут и выбросьте надосадочную жидкость.

Сначала добавьте 125 микролитров магнитных шариков белка А на образец в свежую центрифужную пробирку. Поместите трубку на магнит, чтобы отделить шарики от раствора. Через 10 секунд удалите надосадочную жидкость и дважды промойте шарики 1 миллилитром ледяного буфера для лизиса. Ресуспендируйте гранулы в 100 микролитрах буфера для холодного лизиса с 10 микрограммами антител eCLIP. Вращайте трубки при комнатной температуре в течение 45 минут, затем дважды промойте бусины 1 миллилитром ледяного буфера для лизиса.

Для начала суспендируйте тканевые гранулы в 1 миллилитр буфера для холодного лизиса, содержащего 22 микролитра 50-кратного коктейля ингибиторов белка без ЭДТА и 11 микролитров ингибитора РНКазы. Продолжайте лизировать образцы на льду в течение 15 минут. Ультразвуковая обработка каждого образца изложена в текстовом протоколе. Далее добавьте по 4 микролитра ДНКазы в каждую пробирку и хорошо перемешайте. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, встряхивая со скоростью 1 200 об/мин. После этого добавьте 10 микролитров разведенной РНКазы и хорошо перемешайте. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5 минут, встряхивая со скоростью 1 200 об/мин.

Затем центрифугируйте при 15 000 умноженных на g и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы очистить лизат. Тщательно соберите надосадочную жидкость. Сначала добавьте в подготовленные бусины 1 миллилитр лизата и поверните образцы при температуре 4 градуса Цельсия либо на два часа, либо на ночь. После этого соберите бусины с помощью магнитной подставки и выбросьте надосадочную жидкость. Дважды промойте бусины 900 микролитрами буфера с высоким содержанием соли, а затем дважды промойте бусины 900 микролитрами буфера для стирки.