Анализ клеточного цикла антиген-специфичных CD8⁺ Т-клеток

Возьмите вторичные лимфоидные клетки органов от иммунизированной антигеном мыши, содержащей антиген-специфичные CD8⁺ Т-клетки на разных стадиях клеточного цикла.

G₁, S, G₂ и M являются стадиями активно делящихся клеток, в то время как клетки на стадии G₀ находятся в состоянии покоя.

Добавьте флуоресцентный краситель жизнеспособности для маркировки мертвых клеток, а также помеченные флуорофорами антитела, связывающиеся с маркерами поверхности Т-клеток CD3 и CD8.

Введение мультимеров флуорофор-конъюгированного антигенного пептида-MHC для связывания Т-клеточных рецепторов, маркируя антиген-специфичные Т-клетки.

С помощью буфера зафиксировать и пропитать клетки.

Введение меченных флуорофорами антител для связывания ядерного белка, связанного с пролиферацией клеток, окрашивая активно делящиеся клетки.

Добавьте флуоресцентный краситель к ДНК метки.

С помощью проточной цитометрии выберите живые клетки и идентифицируйте антиген-специфичные CD8⁺ Т-клетки с помощью поверхностных меток.

Интенсивность окрашивания ДНК отличает клетки G₀ и G₁ с меньшим количеством ДНК от клеток S, G₂ и M с большим количеством ДНК. Отсутствие ядерного белок-специфического антитела разделяет клетки G₀.

Приготовьте свежий буфер для промывки 1X permeabilization, разбавив 10X буфер для пермеабилизации дистиллированной водой, и отфильтруйте его через фильтр 0,45 микрометра для удаления заполнителей. Разведите моноклональное антитело Ki67-FITC в буфере для промывки с 1X пермеабилизацией, как было определено с помощью эксперимента по титрованию, для конечного объема 100 микролитров на образец.

Добавьте по 3 миллилитра промывочного буфера 1X для пермеабилизации в каждую пробирку с клетками и центрифугируйте при 400 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Снова добавьте буфер для промывки пермеабилизации 1X и центрифугу для гранулирования клеток, затем выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте в гранулу 100 микролитров разведенного моноклонального антитела Ki67-FITC, затем, вортексируйте и инкубируйте в течение 30 минут в темноте. После инкубации дважды промойте клетки 4 миллилитрами буфера для пермеабилизации 1X, центрифугируя после каждой промывки, и выбросьте надосадочную жидкость.

Добавьте 350 микролитров PBS в клеточную гранулу для образцов, которые будут получены непосредственно на проточном цитометре, и 250 микролитров PBS в клеточную гранулу для образцов, которые будут инкубированы с помощью Hoechst для окрашивания ДНК. Приготовьте раствор Хёхста и PBS и добавьте его в каждый образец, чтобы конечная концентрация составила 2 микрограмма на миллилитр. Сделайте вихрь и инкубируйте образцы в течение 15 минут в темноте. Затем центрифугируйте образцы в течение 5 минут и добавьте 350 микролитров PBS в клеточную гранулу.

Откройте программу и создайте различные группы, соответствующие различным анализируемым органам, нажав кнопку «Создать группу» в разделе ленты рабочего пространства. Откройте окно «Изменить группу», дважды щелкнув по названию группы, и синхронизируйте вновь созданные группы, поставив галочку в функции «Синхронизировано».

Перетащите каждый файл FCS в соответствующую группу, затем создайте стратегию стробирования, начиная с сквозной группы LN. Откройте окно графика, дважды щелкнув по полностью окрашенному образцу, чтобы отобразить незарегистрированные события, полученные для этого образца, в виде точечной диаграммы. Обратите внимание, что оси x и y помечены так же, как в файлах FCS, как указано в таблице 2 файла настроек проточного цитометра этой рукописи. Убедитесь, что отображается достаточное количество событий для соответствующей визуализации.

При необходимости откройте «Настройки», нажав на значок сердца на ленте рабочего пространства, выберите «Графики», затем «Точечная диаграмма как тип графика» и проверьте правильность количества точек, нарисованных в соответствующем поле, или измените его. Отобразите незарегистрированные события в окне графика в виде точечной диаграммы с DNA-A по оси x и DNA-W по оси y. Используйте линейную шкалу для обеих осей. При необходимости измените масштаб с логарифмического на линейный, нажав на поле, обозначенное буквой T рядом с каждой осью в окне графика.

Выберите популяцию одной клетки, нажав «Прямоугольник» в разделе «Инструменты для стробирования», затем дважды щелкните в центре прямоугольного строба, чтобы отобразить отдельные ячейки на точечной диаграмме с параметром FSC-A по оси X и красителем мертвых клеток по оси y.

Нажмите на полигон, чтобы выбрать популяцию живых клеток, которая отрицательна на краситель мертвых клеток. Дважды щелкните в центре полигонального строба, чтобы отобразить ячейки в виде точечной диаграммы с параметром FSC-A по оси X и параметром SSC-A по оси y.

Нажмите на Rectangle и создайте «расслабленный» вентиль, чтобы включить все отдельные живые ячейки в этот график. Дважды щелкните в центре ослабленного затвора, чтобы отобразить ячейки в виде точечной диаграммы с CD3 по оси X и CD8 по оси y.

Используйте соответствующий масштаб оси для визуализации в окне графика. При необходимости измените масштаб x и y, щелкнув по полю, обозначенному буквой T рядом с каждой осью. Выберите «Настроить функцию оси» и при необходимости измените параметры «Дополнительные отрицательные декады», «База ширины» и «Положительные декады».

Выделите CD3-положительные, CD8-положительные клетки, нажав на Polygon. Дважды щелкните в центре CD3-положительного, CD8-положительного венто, чтобы отобразить ячейки в виде точечной диаграммы с Tetr-gag по оси x и Pent-gag по оси y. Выберите антиген-специфичные CD8 Т-клетки, нажав на Polygon. Дважды щелкните мышью в центре специфичного для gag затвора, чтобы отобразить клетки на точечной диаграмме с DNA-A по оси x и Ki67 по оси y. Выберите ячейки в различных фазах клеточного цикла, нажав на кнопку «Quad» в разделе «Инструменты для стробирования» в окне графика.